Dette manuskriptet beskriver en ny direkte planteinfusjonsanordning for screening av molekylers effektivitet mot bakteriene (Candidatus Liberibacter asiaticus) eller dens insektvektor (Diaphorina citri, Kuwayama) som i kombinasjon er assosiert med Huanglongbing sitrussykdom.
Testing av funksjonen av terapeutiske forbindelser i planter er en viktig del av landbruksforskningen. Blad- og jorddrenchmetoder er rutinemessige, men har ulemper, inkludert variabelt opptak og miljømessig nedbrytning av testede molekyler. Stammeinjeksjon av trær er veletablert, men de fleste metoder for dette krever dyrt, proprietært utstyr. For å skjerme ulike behandlinger for Huanglongbing, er det nødvendig med en enkel, billig metode for å levere disse forbindelsene til det vaskulære vevet av små drivhusdyrkede sitrustrær infisert med den floembegrensede bakterien Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) eller infisert med floemmatende CLas insektvektor Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
For å oppfylle disse screeningkravene ble det designet en direkte planteinfusjonsenhet (DPI) som kobles til plantens bagasjerom. Enheten er laget ved hjelp av et nylonbasert 3D-utskriftssystem og lett oppnåelige hjelpekomponenter. Den sammensatte opptakseffekten av denne enheten ble testet i sitrusplanter ved bruk av fluorescerende markør 5,6-karboksyfluorescein-diacetat. Ensartet sammensatt fordeling av markøren gjennom plantene ble rutinemessig observert.
Videre ble denne enheten brukt til å levere antimikrobielle og insekticide molekyler for å bestemme deres effekter på henholdsvis CLas og D. citri. Aminoglykosidantibiotikumet streptomycin ble levert til CLas-infiserte sitrusplanter ved hjelp av enheten, noe som resulterte i en reduksjon i CLas-titeren fra 2 uker til 4 uker etter behandling. Levering av neonicotinoid insekticid imidakloprid i D. citri-infiserte sitrusplanter resulterte i en signifikant økning i psyllid dødelighet etter 7 dager. Disse resultatene tyder på at denne DPI-enheten representerer et nyttig system for å levere molekyler til planter for testing og lette forsknings- og screeningsformål.
Forvaltningen av planter i kommersielle og landskapsinnstillinger krever ofte bruk av kjemiske forbindelser for å optimalisere plantevekst og helse. Hvordan disse molekylene leveres avhenger av typen molekyl, molekylets funksjon, type plante og styringssystemet på plass. Blad- og jordapplikasjoner er de enkleste leveringsstrategiene, men begrensninger i opptaket av noen molekyler krever direkte levering. Et eksempel på disse molekylene er terapeutiske molekyler som fungerer best når de beveger seg systemisk i planten, men kan ikke effektivt leveres ved enkle topiske applikasjoner1. Dette er tilfellet med Huanglongbing (HLB), også kalt sitrus greening sykdom. HLB er en sykdom assosiert med en floem-begrenset bakterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), som ikke kan dyrkes utenfor planten, eller dens insektvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Hvis de antatte terapeutiske molekylene er genprodukter, kan de testes ved å skape transgene planter som uttrykker disse forbindelsene. Transgen planteproduksjon kan imidlertid være tid- og ressurskrevende, er svært genotypeavhengig og kan hemmes ved geninaktivering3. I tillegg, selv om disse transgene viser lovende resultater, reduserer regulatoriske og offentlige oppfatningsbegrensninger sannsynligheten for deres kommersielle aksept 4,5. Den eksogene anvendelsen av forbindelser forenkler imidlertid testingen av biologiske og syntetiske molekyler fordi den ikke krever produksjon av stabile eller forbigående uttrykkende transgene planter, noe som reduserer tiden og ressursene for å teste et molekyls effekter. En metode for effektiv systemisk plantelevering av eksogene forbindelser kan brukes til et bredt spekter av forsknings- og screeningsformål.
En av disse applikasjonene er analysen av systemisk molekylbevegelse i plantens vaskulære system, som kan gjøres ved hjelp av sporbare markører, enten de er fluorescerende, synlige eller unike kjemiske isotoper 6,7,8,9. En vanlig brukt fluorescerende markør er 5,6-karboksyfluorescein-diacetat (CFDA), som er et membranpermeabelt fargestoff som nedbrytes av intracellulære esteraser til 5,6-karboksyfluorescein (CF) og deretter blir fluorescerende og membran-ugjennomtrengelig10. CFDA har blitt mye brukt til å overvåke floemtransport, synke og kildeforhold, og vaskulaturmønster i plantevev11,12.
I tillegg til disse markørene kan visse forbindelser direkte endre plantens fysiologi for å øke produktiviteten eller drepe planten når det gjelder herbicider. Både insektmidler og antimikrobielle forbindelser er et middel til å øke planteproduktiviteten, spesielt i nærvær av HLB. Et eksempel på et antimikrobielt molekyl som brukes til å kontrollere CLas er streptomycin. Streptomycin er et aminoglykosidantibiotikum som opprinnelig ble isolert fra Streptomyces griseus og har vist seg å hemme bakterievekst gjennom hemming av proteinbiosyntese13. Når det gjelder insektmidler, er hovedmålet for HLB-forskning D. citri, som overfører CLas fra tre til tre14. Til dette formål brukes neonicotinoider, som imidakloprid, ofte, da de er gullstandarden for å kontrollere15. Alle disse varierte bruksområdene er viktige aspekter ved dagens anleggsstyringsstrategier, og utviklingen av nye produkter er avhengig av effektive screeninganalyser.
En metode som brukes til innføring av forbindelser i treaktige planter, er direkte injeksjon i bagasjerommet. Det er designet en rekke systemer som varierer i behov for forborede injeksjonssteder, og disse systemene benytter enten trykkbasert injeksjon eller passiv strømning16. Selv om trykkbaserte systemer tillater rask innføring av en gitt forbindelse, må den potensielle fysiske skaden forårsaket av å tvinge væske gjennom blokkert eller embolisert vaskulatur vurderes17. Selv om blad- eller drenchapplikasjon av forbindelser er mindre tidkrevende å implementere, reduserer direkte planteinjeksjon avfall av forbindelsen av interesse på grunn av tap til luft eller jord, og kan også forlenge tiden som forbindelser er i aktiv tilstand ved å redusere eksponeringen for det ytre miljøet18. Begge disse aspektene er viktige for å bevare dyre reagenser og sikre konsistens mellom replikater i forskningsinnstillinger.
Denne studien beskriver design, konstruksjon og bruk av en innovativ direkte planteinfusjonsenhet (DPI), som kan brukes til å vurdere hvordan forbindelser av interesse påvirker en vertsplante. En standard 3D-skriver ble brukt til å produsere både selve enheten og flere komponenter knyttet til konstruksjonen. Denne interne konstruksjonsmetoden gjør det mulig for forskere å modifisere enhetens og enhetens komponenter basert på deres spesifikke eksperimentelle behov og reduserer avhengigheten av kommersielt tilgjengelige planteinjeksjonsenheter. Enhetsoppsettet er enkelt og effektivt, og alle hjelpekomponentene er lett tilgjengelige og rimelige. Selv om systemet ble designet for bruk med en rekke plantearter, gjelder eksemplene som presenteres her pottesitrusplanter. I tillegg viser denne studien at denne enheten er i stand til effektivt å levere flere typer forbindelser systemisk til unge sitrusplanter uten å forårsake dødelighet. De testede forbindelsene inkluderte CFDA, som ble brukt til å vurdere forbindelsesfordelingen i planten, og streptomycin og imidakloprid, som ble brukt til å verifisere at de antimikrobielle og insekticide effektene av disse forbindelsene ble observert når de ble levert via DPI.
For at DPI-enheten skal betraktes som en levedyktig metode for eksogen sammensatt levering i planter, må den bidra til robust og konsistent forbindelsesopptak i en rekke vevstyper. Eksperimentet ved bruk av CFDA viste tydelig både akropetal og basipetal forbindelsesbevegelse, så vel som i både det vaskulære systemet og mesofyllceller i bladet. I tillegg, og antagelig fordi det kjedelige hullet som brukes i denne DPI-enheten gir en stor mengde overflateareal for sammensatt opptak, var CFDA tilstede i relativt like store mengder i alle deler av stammen, ikke bare i en liten delmengde av vaskulaturen ved siden av enheten, som det har blitt sett i tidligere fargestoffopptaksstudier i planter som bruker stammeinjeksjon6. I tillegg ble leveransen av grønt fluorescerende protein og blomsterfargestoff testet ved bruk av DPI-enheten, og en fordeling av disse forbindelsene som ligner CFDA ble observert (data ikke vist). Disse dataene antyder at enheten kan brukes til systematisk å levere en rekke forbindelser som varierer i størrelse og molekylær struktur. Det er imidlertid verdt å merke seg at det var forskjeller i det sammensatte opptaket basert på bladutviklingsstadiet, med yngre utviklende blader som tar opp mer sammensatte enn eldre etablerte blader. Dette kan skyldes endringene i vaskulaturegenskapene som finnes i vask versus kildevev og bør optimaliseres for et gitt eksperiment.
DPI-enheten viste tilstrekkelig sammensatt opptak for visualisering av CFDA, GFP og blomsterfargestoff, og det tok også opp nok til å vise de antibakterielle og insekticide effektene av henholdsvis streptomycin og imidakloprid. Begge disse forbindelsene resulterte i endringer i målorganismens levedyktighet 1 uke etter en enkelt 2,0 ml behandling. Disse dataene tyder på at DPI-enheten kan brukes i helplanteanalyser for å teste levedyktigheten til et bredt utvalg av forbindelser for kontroll av mikrobielle og. Videre, på grunn av sin direkte kontakt med det vaskulære systemet, kan denne enheten til og med gi en mulighet til å teste forbindelser som ikke effektivt tas opp av røttene eller epidermale celler. Av spesiell interesse vil være RNA-interferens (RNAi), da dette kan brukes til å modulere genuttrykket i vertsplanten, patogenet eller patogenvektoren. Tidligere forskning som introduserte hårnåls-RNA gjennom et boret hull i stammen av eple- og drueplanter, viste at RNA-molekylene var begrenset til xylemvevet, noe som tyder på at disse molekylene bare kan være effektive mot tygge og xylem-saftfôrende organismer22. Gitt at DPI-enheten bruker et lignende borehullleveringssystem, er det grunnen til at hårnåls-RNA levert med denne enheten også kan være begrenset til xylemvevet. Den observerte reduksjonen i titer av floem-begrensede CLas etter streptomycinbehandling fra DPI-enheten antyder imidlertid sterkt at dette antibiotika var tilstede i floem. Derfor er det sannsynlig at den vaskulære fordelingen av forbindelsene som leveres ved hjelp av DPI-enheten, er avhengig av deres størrelse og kjemi, og hvert molekyl bør vurderes individuelt.
Selv om det finnes en rekke kommersielt tilgjengelige DPI-enheter tilgjengelig på markedet, kan enheten beskrevet her produseres internt og kan modifiseres. På denne måten kan forbedringer og endringer i størrelse gjøres basert på planteart og eksperimentell design som brukes, og det er ikke avhengig av kommersielle produkter. I tillegg er enheten semi-permanent festet til anlegget, noe som betyr at flere behandlinger av en gitt forbindelse kan utføres samtidig uten å måtte skade planten med flere sammensatte injeksjoner. På en advarsel kan enheten lekke hvis den ikke er riktig installert. Som et resultat går forbindelsen tapt for miljøet i stedet for å bli levert til anlegget. Det bør derfor utvises forsiktighet for å inspisere enheten for tegn på lekkasje under oppsettet og de første dagene etterpå. Selv om boring av et hull i treet er potensielt skadelig, ble denne metoden valgt for å sikre robust og konsistent opptak. I tillegg ble det ikke sett noen negative effekter på plantehelsen fra vedlegget av DPI-enheten i disse forsøkene. Imidlertid bør ekstra planter inkluderes i eksperimentell design for å erstatte de som kan miste kraft i løpet av et gitt eksperiment. Til slutt, siden denne enheten bruker passiv strømning for å introdusere forbindelser, kan det være vanskelig å forutsi opptakshastigheten på tvers av forskjellige plantearter eller utviklingsstadier av samme art. Dette kan komplisere eksperimenter hvis hastigheten på opptaket av forbindelser er en begrensende faktor. For best resultat bør eksperimenter planlegges slik at planten får tilstrekkelig tid til å absorbere 2,5 ml forbindelsen, noe som kan ta opptil 1 uke. Avslutningsvis er denne DPI-enheten et effektivt verktøy for rask evaluering av in planta-aktiviteten til antimikrobielle eller insekticide forbindelser mot CLas og dens vektor, D. citri, og gir dermed mer informasjon om systemisk effektivitet og innflytelse på plantens ytelse enn den tidligere presenterte frittliggende bladanalysen23. Utvilsomt når mangfoldet av applikasjoner for dette systemet langt utover de spesifikke bruksområdene som er beskrevet i denne studien.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Mant Acon for plantene som ble brukt i denne studien. Finansieringen ble gitt av US Department of Agriculture (USDA) CRIS prosjekt 8062-22410-007-000-D og USDA NIFA tilskudd 2020-70029-33176.
0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
Parafilm | Bemis | HS234526A | |
Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |