Colocación de electrodos estimulantes extracraneales y medición del flujo sanguíneo cerebral y campos eléctricos intracraneales en ratones anestesiados

Summary

Describimos un protocolo para evaluar las curvas dosis-respuesta para la estimulación extracraneal en términos de medidas del campo eléctrico cerebral y un biomarcador relevante: flujo sanguíneo cerebral. Dado que este protocolo implica la colocación de electrodos invasivos en el cerebro, se necesita anestesia general, y se prefiere la respiración espontánea en lugar de la respiración controlada.

Abstract

La detección de las respuestas del flujo sanguíneo cerebral (CBF) a diversas formas de activación neuronal es fundamental para comprender la función cerebral dinámica y las variaciones en el suministro de sustrato al cerebro. En este artículo se describe un protocolo para medir las respuestas de CBF a la estimulación transcraneal de corriente alterna (tACS). Las curvas dosis-respuesta se estiman tanto a partir del cambio de CBF que se produce con tACS (mA) como del campo eléctrico intracraneal (mV/mm). Estimamos el campo eléctrico intracraneal en función de las diferentes amplitudes medidas por microelectrodos de vidrio dentro de cada lado del cerebro. En este artículo, describimos la configuración experimental, que implica el uso de sondas Doppler láser (LD) bilaterales o imágenes de moteado láser (LSI) para medir el CBF; Como resultado, esta configuración requiere anestesia para la colocación y estabilidad del electrodo. Presentamos una correlación entre la respuesta de CBF y la corriente en función de la edad, mostrando una respuesta significativamente mayor a corrientes más altas (1,5 mA y 2,0 mA) en animales control jóvenes (12-14 semanas) en comparación con animales mayores (28-32 semanas) (p < 0,005 de diferencia). También demostramos una respuesta significativa de CBF a intensidades de campo eléctrico <5 mV/mm, lo cual es una consideración importante para eventuales estudios en humanos. Estas respuestas de CBF también están fuertemente influenciadas por el uso de anestesia en comparación con los animales despiertos, el control de la respiración (es decir, respiración intubada vs. espontánea), factores sistémicos (es decir, CO₂) y la conducción local dentro de los vasos sanguíneos, que está mediada por pericitos y células endoteliales. Del mismo modo, las técnicas de imagen/grabación más detalladas pueden limitar el tamaño del campo de todo el cerebro a solo una pequeña región. Describimos el uso de electrodos extracraneales para la aplicación de la estimulación con tACS, incluyendo diseños de electrodos caseros y comerciales para roedores, la medición concurrente del CBF y el campo eléctrico intracraneal utilizando electrodos bilaterales de registro de CC de vidrio, y los enfoques de imagen. Actualmente estamos aplicando estas técnicas para implementar un formato de circuito cerrado para aumentar el CBF en modelos animales de enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular.

Introduction

La estimulación eléctrica transcraneal (tES; con estimulación de onda sinusoidal, tACS) es un abordaje común, externo y no invasivo para la neuromodulación cerebral ^1,2. Anteriormente, planteamos la hipótesis de que a ciertas dosis, la tES (y en particular la tACS) puede aumentar el flujo sanguíneo cerebral (CBF) en las regiones cerebrales subyacentes³. Además, puede existir una relación dosis-respuesta entre la corriente externa aplicada o el campo eléctrico intracraneal y las respuestas de CBF resultantes. Sin embargo, la mayoría de los protocolos de estimulación clínica se han centrado en un nivel máximo de estimulación de la piel cómoda (es decir, ~ 2 mA) durante períodos de tiempo programados (es decir, 30-45 min) como protocolo de tratamiento ^4,5. En roedores, es posible utilizar electrodos cerebrales invasivos extracraneales aplicados directamente al cráneo para investigar los campos eléctricos en el cerebro inducidos por tES⁶. Por lo tanto, el objetivo de este enfoque es determinar los efectos de la intensidad de la tACS a frecuencias relevantes sobre los cambios en el CBF en términos de la relación dosis-respuesta. Esta curva dosis-respuesta se basa en un biomarcador fisiológico a corto plazo -medidas directas del CBF- en relación con el campo eléctrico impuesto al cerebro³. Hemos demostrado previamente que, a amplitudes más grandes, típicamente más allá del rango de campos eléctricos dentro del cerebro inducidos clínicamente por tACS, existe una correlación casi lineal entre el campo eléctrico inducido y el CBF en la corteza³. Sin embargo, la estimulación de campo más pequeño (es decir, intensidad de 1-5 mV/mm) puede ser más relevante y factible para su uso en humanos; por lo tanto, hemos modificado nuestras técnicas para detectar cambios más pequeños en el CBF.

En este artículo se describe un protocolo para analizar los efectos de las corrientes sinusoidales alternas (tACS) de tES de menor intensidad de campo sobre el CBF (es decir, corriente de 0,5-2,0 mA, campo eléctrico de 1-5 mV/mm), que pueden ser tolerados por roedores despiertos⁵. Este protocolo implica el uso de nuevas imágenes de moteado láser durante la tACS, así como dos electrodos de vidrio intracraneales, para determinar tanto la propagación de la tACS activa dentro del cerebro (según lo monitoreado por la CBF) como la intensidad del campo eléctrico intracraneal, que se muestra como un diagrama y una fotografía experimental real (Figura 1). Hay muchos efectos fisiológicos posibles de la tES dentro del cerebro, incluida la modulación neuronal directa, la plasticidad neuronal y la activación de los astrocitos ^7,8. Aunque el CBF se ha medido con tDCS ^9,10, estas mediciones fueron lentas, indirectas e insuficientes para evaluar la función dosis-respuesta en el cerebro. Por lo tanto, mediante el uso de biomarcadores apropiados a corto plazo (es decir, CBF, campos eléctricos) y secuencias rápidas de encendido/apagado de tACS, ahora podemos estimar la función dosis-respuesta con mayor precisión. Además, podemos aplicar diferentes técnicas para medir el CBF, incluyendo tanto sondas Doppler láser focales (LD) como imágenes de moteado láser (LSI) con regiones de interés definidas.

Figura 1: Diagrama de estimulación transcraneal y ejemplo fotográfico. (A) Diagrama de la configuración de la estimulación transcraneal. El diagrama muestra un cráneo de ratón con suturas coronales y sagitales. Los electrodos transcraneales se colocan lateral y simétricamente en el cráneo y se montan con pegamento quirúrgico y pasta conductora entre los electrodos y el cráneo. Estos electrodos están conectados a un dispositivo de estimulación de corriente constante compatible con humanos, que puede especificar la frecuencia, la amplitud y la duración de la estimulación. Para la evaluación de los campos eléctricos intracraneales, se colocan electrodos de vidrio bilaterales (~2 MΩ) en la corteza cerebral (es decir, a menos de 1 mm de la cara interna del cráneo a través de pequeños orificios de rebaba), y estos se sellan con aceite mineral y tienen molienda de AgCl en el músculo del cuello (que se muestra como cables más grandes en el centro enterrados en el tejido subcutáneo del cuello). Estos electrodos de vidrio están conectados a un amplificador de CC y sus salidas se registran a través de un digitalizador con al menos cuatro canales. También se colocan sondas láser Doppler bilaterales en el cráneo para realizar grabaciones. También se obtienen imágenes de todo el cráneo con un dispositivo de imágenes de moteado láser o una cámara refrigerada de alta resolución (al menos 1.024 x 1.024 píxeles, profundidad de píxeles de 12-14 bits) para la detección de señales ópticas intrínsecas. Por lo general, se elige la frecuencia isosbética de la hemoglobina (es decir, 562 nm) para la iluminación de las imágenes del flujo sanguíneo. (B) Una imagen en primer plano de un experimento real, que muestra las sondas Doppler láser bilaterales (a la izquierda), los microelectrodos de registro de vidrio intracraneal (bilaterales) colocados a través de los orificios de rebaba y con los electrodos de estimulación de tACS lateralmente. Abreviatura: tACS = estimulación transcraneal de corriente alterna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como forma de evaluar los mecanismos, también podemos interrogar las interacciones con otros procesos fisiológicos que también alteran el CBF, como la despolarización de propagación inducida por K^{+ 11}. Además, en lugar de sesiones programadas en horarios regulares, también es posible desarrollar un sistema de circuito cerrado basado en biomarcadores adicionales para una variedad de enfermedades, como se ha propuesto para el tratamiento de la epilepsia¹² (es decir, dispositivos clínicos Neuropace). Por ejemplo, la estimulación cerebral de circuito cerrado para la enfermedad de Parkinson se basa comúnmente en los potenciales de campo local (LFP) intrínsecos y anormales intrínsecos a esta enfermedad en ausencia de suficiente dopamina (típicamente LFP de banda β⁾¹³.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke o la autoridad local equivalente que regula la investigación con animales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, instrumentos y equipos utilizados en este protocolo. 1. Preparación del instrumento Asegúrese de que todos los elementos e instrumentos quirúrgicos necesa…

Representative Results

Los resultados representativos se muestran en la Figura 4, la Figura 5 y la Figura 6. La Figura 4 muestra un ejemplo de los cuatro canales con los dos electrodos de registro intracraneal en los canales superiores y las respuestas CBF en los canales inferiores. El tACS es simétrico a lo largo del cráneo, pero en general, la respuesta del campo intracraneal es ligeramente asimétrica para las corrientes…

Discussion

Este protocolo se centra en la medición in vivo, anestesiada, de la respuesta de CBF como biomarcador para estimar la respuesta cerebral a tES¹⁴. Los biomarcadores a largo plazo de la respuesta a la TES incluyen los efectos histológicos del tratamiento, como la prevención o los cambios en la formación de placa amiloide (es decir, con estimulación gamma a 40 Hz en varios modelos de EA)^{16,17,18,19,<…}

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784