小鼠关节炎组织中原代滑膜巨噬细胞和成纤维细胞的分离和培养
Summary
本研究提供了一种改进的方案，用于从小鼠炎性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。
Abstract
类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，会导致关节慢性炎症。滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞在类风湿性关节炎的发病机制中起核心作用。重要的是要了解两个细胞群的功能，以揭示炎症性关节炎病理进展和缓解的机制。一般来说， 体外 实验条件应尽可能模仿 体内 环境。原代组织来源细胞已被用于表征关节炎滑膜成纤维细胞的实验。相反，在研究巨噬细胞在炎症性关节炎中的生物学功能的实验中，已经使用了细胞系、骨髓来源的巨噬细胞和血单核细胞来源的巨噬细胞。然而，目前尚不清楚这些巨噬细胞是否真的反映了组织驻留巨噬细胞的功能。为了获得常驻巨噬细胞，修改了先前的方案以在炎性关节炎小鼠模型中从滑膜组织中分离和扩增原代巨噬细胞和成纤维细胞。这些原代滑膜细胞可用于炎症性关节炎的 体外 分析。
Introduction
类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生，导致关节破坏1,2。组织驻留的巨噬细胞和成纤维细胞存在于健康的滑膜中，以维持关节稳态。在 RA 患者中，滑膜成纤维细胞 （SF） 增殖，免疫细胞（包括单核细胞）浸润到滑膜和关节液中，与炎症相关的过程 1,3,4。滑膜巨噬细胞 （SM），包括常驻巨噬细胞和外周血单核细胞来源的巨噬细胞，以及 SF 异常激活，在 RA 发病机制中起重要作用。最近的研究表明，SM和SF之间的细胞间相互作用有助于RA 5,6的恶化和缓解。
为了了解RA的发病机制，已经使用了几种啮齿动物的炎症性关节炎模型，包括K/BxN血清转移关节炎、胶原蛋白诱导的关节炎和胶原抗体诱导的关节炎。通常需要基于细胞的测定来阐明关节炎的分子功能。因此，已经分离出关节炎动物模型中的原代细胞。从小鼠关节炎组织中分离SFs的方法已经建立，这些细胞有助于阐明关节炎发病机制中的分子机制7,8。另一方面，骨髓来源的巨噬细胞、血单核细胞来源的巨噬细胞和巨噬细胞系经常被用作关节炎研究的巨噬细胞资源9,10。由于巨噬细胞可以获得与其微环境相关的功能，因此巨噬细胞的一般来源可能缺乏关节炎组织特有的反应。此外，很难通过分选获得足够的滑膜细胞，因为即使在关节炎模型中，鼠滑膜也是一个非常小的组织。缺乏滑膜巨噬细胞用于体外研究一直是关节炎研究的局限性。建立分离和扩增滑膜巨噬细胞的方案对于阐明RA的病理机制将是一个优势。
在以前的SF分离方法中，SM被丢弃7。除此之外，据报道了一种从某些器官分离和扩增常驻巨噬细胞的方法11。因此，对现有协议进行了组合修改。该改性旨在实现SM和SF的原代培养物具有高纯度。该方法的总体目标是从小鼠关节炎组织中分离和扩增SM和SF。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里开发的这种方法改进了以前从小鼠关节炎中分离SF和从许多器官中分离常驻巨噬细胞的技术7,11。改进的方法可以从炎性滑膜中分离出巨噬细胞和成纤维细胞，纯度高，简单易重复。由于该方法不需要细胞分选仪等复杂仪器，因此任何人都可以进行。此外，本技术避免了与其他方法相关的问题，例如荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢医学研究支持部，高级研究支持中心（ADRES）的工作人员以及爱媛大学蛋白质科学中心（PROS）综合病理生理学部的成员，感谢他们的技术援助和有益的支持。这项研究得到了日本科学促进会（JSPS）KAKENHI赠款JP17K17929，JP19K16015，JP21K05974（NS）和JP23689066，JP15H04961，JP15K15552，JP17K19728，JP19H03786（YI）的部分支持;大阪疑难病医学研究财团、中富财团、日本骨与矿物研究学会（JSBMR）明日之星财团、住友财团、SENSHIN医学研究财团、望田纪念财团（致NS）的资助;以及武田科学基金会医学研究基金、UCB日本（UCBJ）项目资助和2019年JSBMR前沿科学家资助（致YI）。
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
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