Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina
Summary
Il presente studio fornisce un protocollo modificato per isolare i macrofagi sinoviali e i fibroblasti dal tessuto dell’artrite infiammatoria murina.
Abstract
L’artrite reumatoide è una malattia autoimmune che porta all’infiammazione cronica delle articolazioni. I macrofagi sinoviali e i fibroblasti sinoviali hanno ruoli centrali nella patogenesi dell’artrite reumatoide. È importante comprendere le funzioni di entrambe le popolazioni cellulari per rivelare i meccanismi alla base della progressione patologica e della remissione nell’artrite infiammatoria. In generale, le condizioni sperimentali in vitro dovrebbero imitare il più possibile l’ambiente in vivo . Le cellule primarie derivate dai tessuti sono state utilizzate in esperimenti che caratterizzano i fibroblasti sinoviali nell’artrite. Al contrario, negli esperimenti che studiano le funzioni biologiche dei macrofagi nell’artrite infiammatoria, sono state utilizzate linee cellulari, macrofagi derivati dal midollo osseo e macrofagi derivati dai monociti del sangue. Tuttavia, non è chiaro se tali macrofagi riflettano effettivamente le funzioni dei macrofagi residenti nei tessuti. Per ottenere macrofagi residenti, i protocolli precedenti sono stati modificati per isolare ed espandere sia i macrofagi primari che i fibroblasti dal tessuto sinoviale in un modello murino di artrite infiammatoria. Queste cellule sinoviali primarie possono essere utili per l’analisi in vitro dell’artrite infiammatoria.
Introduction
L’artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune caratterizzata da iperplasia della sinovia, che porta alla distruzione articolare 1,2. I macrofagi e i fibroblasti residenti nei tessuti sono presenti nella sinovia sana per mantenere l’omeostasi articolare. Nei pazienti con AR, i fibroblasti sinoviali (SF) proliferano e le cellule immunitarie, compresi i monociti, si infiltrano nella sinovia e nel liquido articolare, processi associati all’infiammazione 1,3,4. I macrofagi sinoviali (SM), che comprendono i macrofagi residenti e i macrofagi derivati dai monociti del sangue periferico, e i SF sono attivati in modo aberrante e hanno ruoli importanti nella patogenesi dell’AR. Studi recenti hanno suggerito che le interazioni cellula-cellula tra SM e SF contribuiscono sia all’esacerbazione che alla remissione di RA 5,6.
Per comprendere la patogenesi dell’AR, sono stati utilizzati diversi modelli di roditori di artrite infiammatoria, tra cui l’artrite da trasferimento del siero K / BxN, l’artrite indotta dal collagene e l’artrite indotta da anticorpi al collagene. I saggi basati sulle cellule sono generalmente necessari per chiarire le funzioni molecolari nell’artrite. Pertanto, sono state isolate cellule primarie da modelli animali di artrite. Il metodo per isolare le SF dal tessuto dell’artrite murina è ben consolidato, e queste cellule hanno contribuito alla delucidazione dei meccanismi molecolari nella patogenesi dell’artrite 7,8. D’altra parte, i macrofagi derivati dal midollo osseo, i macrofagi derivati dai monociti del sangue e le linee cellulari dei macrofagi sono stati spesso utilizzati come risorse macrofagiche per gli studi sull’artrite 9,10. Poiché i macrofagi possono acquisire funzioni associate al loro microambiente, le fonti generali di macrofagi possono mancare di risposte specifiche al tessuto artrite. Inoltre, è difficile ottenere abbastanza cellule sinoviali mediante selezione, poiché la sinovia murina è un tessuto molto piccolo anche nei modelli di artrite. La mancanza di utilizzo di macrofagi sinoviali per studi in vitro è stata una limitazione negli studi sull’artrite. L’istituzione di un protocollo per isolare ed espandere i macrofagi sinoviali sarebbe un vantaggio per la delucidazione dei meccanismi patologici nell’AR.
Nel metodo precedente per isolare le SF, gli SM sono stati scartati7. Oltre a ciò, è stato riportato un metodo per isolare ed espandere i macrofagi residenti da alcuni organi11. Pertanto, i protocolli esistenti sono stati modificati in combinazione. La modifica mira a raggiungere la cultura primaria sia di SM che di SF con elevata purezza. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare ed espandere sia SM che SF dal tessuto di artrite murina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo sviluppato qui migliora le tecniche precedenti per isolare sia le SF dall’artrite murina che i macrofagi residenti da un certo numero di organi 7,11. Il metodo modificato può isolare sia i macrofagi che i fibroblasti dalla sinovia infiammatoria con elevata purezza ed è semplice e riproducibile. Poiché il metodo non richiede strumenti complessi come uno smistatore cellulare, chiunque può condurlo. Inoltre, la presente tecnica evita preoccupazioni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano lo staff della Division of Medical Research Support, l’Advanced Research Support Center (ADRES) e i membri della Division of Integrative Pathophysiology, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, per la loro assistenza tecnica e il loro utile supporto. Questo studio è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (a NS) e JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (a YI); sovvenzioni della Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (to NS); e una sovvenzione per la ricerca medica della Takeda Science Foundation, una sovvenzione per progetti UCB Japan (UCBJ) e la sovvenzione JSBMR Frontier Scientist 2019 (a YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
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