쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양
Summary
본 연구는 쥐의 염증성 관절염 조직으로부터 활막 대식세포 및 섬유아세포를 분리하기 위한 수정된 프로토콜을 제공한다.
Abstract
류마티스 관절염은 관절의 만성 염증을 유발하는자가 면역 질환입니다. 활막 대식세포와 활막 섬유아세포는 류마티스 관절염의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 염증성 관절염의 병리학적 진행과 완화의 기본 메커니즘을 밝히기 위해 두 세포 집단의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 일반적으로, 시험관 내 실험 조건은 가능한 한 생체내 환경을 모방해야 한다. 일차 조직 유래 세포는 관절염에서 활막 섬유아세포를 특성화하는 실험에 사용되었습니다. 이에 반해 염증성 관절염에서 대식세포의 생물학적 기능을 조사하는 실험에서는 세포주, 골수 유래 대식세포, 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하였다. 그러나, 이러한 대식세포가 실제로 조직에 상주하는 대식세포의 기능을 반영하는지 여부는 불분명하다. 상주하는 대식세포를 얻기 위해, 이전 프로토콜은 염증성 관절염 마우스 모델에서 활막 조직에서 일차 대식세포와 섬유아세포를 모두 분리하고 확장하도록 수정되었습니다. 이러한 일차 활막 세포는 염증성 관절염의 시험관내 분석에 유용할 수 있습니다.
Introduction
류마티스 관절염 (RA)은 활액막의 증식을 특징으로하는자가 면역 질환으로 관절 파괴를 유발합니다 1,2. 조직에 상주하는 대식세포와 섬유아세포는 관절 항상성을 유지하기 위해 건강한 활막에 존재합니다. RA 환자에서, 활막 섬유아세포(SFs)가 증식하고, 단핵구를 포함한 면역 세포가 활막 및 관절액으로 침윤하며, 염증과 관련된 과정이다 1,3,4. 상주 대식세포 및 말초 혈액 단핵구 유래 대식세포를 포함하는 활막 대식세포(SM) 및 SF는 비정상적으로 활성화되며 RA 발병기전에서 중요한 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 SM과 SF 사이의 세포-세포 상호작용은 RA 5,6의 악화 및 완화 모두에 기여합니다.
RA 발병기전을 이해하기 위해 K/BxN 혈청 전달 관절염, 콜라겐 유도 관절염 및 콜라겐 항체 유도 관절염을 포함하여 염증성 관절염의 여러 설치류 모델이 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 일반적으로 관절염의 분자 기능을 명확히 하는 데 필요합니다. 따라서 관절염 동물 모델로부터의 일차 세포가 분리되었다. 쥐의 관절염 조직으로부터 SF를 분리하는 방법은 잘 확립되어 있으며, 이들 세포는 관절염 발병기전에서 분자 기전의 해명에 기여하였다 7,8. 한편, 골수 유래 대식세포, 혈액 단핵구 유래 대식세포 및 대식세포 세포주는 관절염 연구를 위한 대식세포 자원으로 자주 사용되어 왔다 9,10. 대식세포는 미세 환경과 관련된 기능을 획득할 수 있기 때문에 대식세포의 일반적인 공급원은 관절염 조직에 특이적인 반응이 부족할 수 있습니다. 또한, 쥐의 활막은 관절염 모델에서도 매우 작은 조직이기 때문에 분류하여 충분한 활막 세포를 얻는 것이 어렵습니다. 시험관 내 연구를 위한 활막 대식세포의 사용 부족은 관절염 연구의 한계였습니다. 활막 대식세포를 분리하고 확장하기 위한 프로토콜의 확립은 RA에서 병리학적 기전을 밝히는 데 이점이 될 것입니다.
SF를 분리하는 이전 방법에서는 SM을 폐기했습니다7. 그 외에도 일부 장기에서 상주하는 대식세포를 분리하고 확장하는 방법이 보고되었다11. 따라서 기존 프로토콜이 조합되어 수정되었습니다. 수정은 고순도로 SM과 SF 모두의 1차 배양을 달성하는 것을 목표로 합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 쥐 관절염 조직에서 SM과 SF를 모두 분리하고 확장하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 개발된 이 방법은 쥐 관절염으로부터 SF와 다수의 장기로부터 상주하는 대식세포를 분리하기 위한 이전의 기술들을 개선한다 7,11. 변형된 방법은 염증성 활막에서 대식세포와 섬유아세포를 모두 고순도로 분리할 수 있으며 간단하고 재현성이 있습니다. 이 방법은 세포 분류기와 같은 복잡한 도구가 필요하지 않기 때문에 누구나 수행 할 수 있…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 에히메 대학 의료 연구 지원부, 고급 연구 지원 센터 (ADRES) 및 통합 병태 생리학 부서 (PROS) 구성원의 기술 지원과 유용한 지원에 감사드립니다. 이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS)의 KAKENHI 보조금 JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (NS) 및 JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (YI)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 난치성 질환 의학 연구 재단, 나카토미 재단, 일본 뼈 및 미네랄 연구 협회 (JSBMR) 라이징 스타 그랜트, 스미토모 재단, 센신 의학 연구 재단, 모치다 기념 재단 (NS에); 다케다 과학 재단 의학 연구 보조금, UCB Japan (UCBJ) 프로젝트 보조금 및 JSBMR Frontier Scientist 보조금 2019 (YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
Riferimenti
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