Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murintartrittvev

Summary

Denne studien gir en modifisert protokoll for å isolere synoviale makrofager og fibroblaster fra murine inflammatorisk leddgiktvev.

Abstract

Revmatoid artritt er en autoimmun sykdom som fører til kronisk betennelse i leddene. Synoviale makrofager og synoviale fibroblaster har sentrale roller i patogenesen ved revmatoid artritt. Det er viktig å forstå funksjonene til begge cellepopulasjoner for å avdekke mekanismene som ligger til grunn for patologisk progresjon og remisjon ved inflammatorisk leddgikt. Generelt bør in vitro eksperimentelle forhold etterligne in vivo-miljøet så mye som mulig. Primære vevsavledede celler har blitt brukt i eksperimenter som karakteriserer synoviale fibroblaster i leddgikt. I motsetning til dette, i eksperimenter som undersøker de biologiske funksjonene til makrofager i inflammatorisk leddgikt, har cellelinjer, benmargsavledede makrofager og blodmonocytavledede makrofager blitt brukt. Det er imidlertid uklart om slike makrofager faktisk gjenspeiler funksjonene til vevsboende makrofager. For å oppnå residente makrofager ble tidligere protokoller modifisert for å isolere og utvide både primære makrofager og fibroblaster fra synovialvev i en inflammatorisk leddgiktmusemodell. Disse primære synovialcellene kan være nyttige for in vitro analyse av inflammatorisk artritt.

Introduction

Revmatoid artritt (RA) er en autoimmun sykdom preget av hyperplasi av synovium, noe som fører til felles ødeleggelse ^1,2. Vevsresidente makrofager og fibroblaster er tilstede i sunn synovium for å opprettholde felles homeostase. Hos RA-pasienter prolifererer synoviale fibroblaster (SF), og immunceller, inkludert monocytter, infiltrerer i synovium og leddvæske, prosesser assosiert med betennelse ^1,3,4. Synoviale makrofager (SM), som inkluderer residente makrofager og perifert blodmonocyttavledede makrofager, og SF er aberrant aktivert og har viktige roller i RA-patogenesen. Nylige studier har antydet at celle-celle-interaksjoner mellom SM og SF bidrar til både forverring og remisjon av RA ^5,6.

For å forstå RA-patogenesen har flere gnagermodeller av inflammatorisk leddgikt blitt brukt, inkludert K / BxN serumoverføringsartritt, kollagenindusert leddgikt og kollagenantistoffindusert leddgikt. Cellebaserte analyser er generelt nødvendig for å avklare molekylære funksjoner ved leddgikt. Derfor har primære celler fra dyremodeller av leddgikt blitt isolert. Metoden for å isolere SF fra murine artrittvev er godt etablert, og disse cellene har bidratt til å belyse molekylære mekanismer i leddgiktpatogenese ^7,8. På den annen side har beinmargsavledede makrofager, blodmonocyttavledede makrofager og makrofagcellelinjer ofte blitt brukt som makrofagressurser for leddgiktstudier ^9,10. Siden makrofager kan skaffe seg funksjoner knyttet til deres mikromiljø, kan generelle kilder til makrofager mangle responser som er spesifikke for leddgiktvev. I tillegg er det vanskelig å få nok synoviale celler ved å sortere, da murine synovium er et svært lite vev selv i leddgiktmodeller. Mangelen på bruk av synoviale makrofager for in vitro-studier har vært en begrensning i leddgiktstudier. Etablering av en protokoll for å isolere og utvide synoviale makrofager vil være en fordel for å belyse patologiske mekanismer i RA.

I den forrige metoden for å isolere SF ble SM kassert⁷. Utover dette ble det rapportert en metode for å isolere og utvide residente makrofager fra noen organer¹¹. Derfor ble eksisterende protokoller modifisert i kombinasjon. Modifikasjonen tar sikte på å oppnå primærkulturen til både SM og SF med høy renhet. Det overordnede målet med denne metoden er å isolere og utvide både SM og SF fra murine artrittvev.

Protocol

Eksperimenter som involverte dyr ble godkjent av Animal Experiment Committee of Ehime University og ble utført i samsvar med Ehime University Guidelines for Animal Experiments (37A1-1 * 16). 1. Klargjøring av instrumenter, reagenser og kulturmedium Forbered kulturmediet som følger: suppler Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotisk løsning (anti-anti). Forbered fordøyelsesmediet som følger…

Representative Results

Kvinnelige C57BL/6-mus ved 7-8 ukers alder gjennomgikk kollagenantistoffindusert artritt. Makrofaglignende celler og fibroblastlignende celler ble uavhengig isolert fra inflammatorisk artrittvev i henhold til prosedyren beskrevet ovenfor (figur 2A,B). Makrofaglignende celler ble umiddelbart brukt etter trinn 5.7. Fibroblastlignende celler ble opprinnelig dyrket for å være subkonfluente etter trinn 4.4, og deretter overført til en ny kulturrett etterfulgt av bruk. For å e…

Discussion

Denne metoden utviklet her forbedrer tidligere teknikker for å isolere både SF fra murine artritt og residente makrofager fra en rekke organer ^7,11. Den modifiserte metoden kan isolere både makrofager og fibroblaster fra inflammatorisk synovium med høy renhet, og den er enkel og reproduserbar. Siden metoden ikke krever komplekse instrumenter som en cellesortering, kan hvem som helst utføre den. I tillegg unngår den nåværende teknikken bekymringer forbunde…

Materials

5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution	nacalai tesque	35556-44	Diluted with HBSS
Antibiotic–antimycotic (anti/anti)	Gibco	15240-062
Butterfly needle	TERUMO	SV-23DLK	23G
Cell strainer	Falcon	352340	40 µm pore, Nylon
Cellmatrix Type I-C	Nitta gelatin	637-00773	Type I-C collagen
Centriguge tube 15	TPP	91014	15 mL tube
Centriguge tube 50	TPP	91050	50 mL tube
Collagenase from C. Histolyticum	Sigma	C5138	Type IV collagenase
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)	Gibco	10569-010
Fetal bovine serum (FBS)	SIGAM	173012	Heat inactivation was performed
Hanks' balanced salt solution (HBSS)	Wako	085-09355
Scissors	Bio Research Center	PRI28-1525A
Tissue culture dish 40	TPP	93040	For cell culture
Tissue culture dish 60	TPP	92006	For cell culture
Tweezers	KFI	1-9749-31	Fine-point
Tweezers	Bio Research Center	PRI28-1522	Serrated tip
ZEISS Stemi 305	ZEISS	STEMI305-EDU	Stereomicroscope