Chick embryon används för att studera humana glioblastom (GBM) hjärntumörer i ovo och i ex vivo brain slice samkulturer. GBM-cellbeteende kan registreras genom time-lapse-mikroskopi i ex vivo-samkulturer, och båda preparaten kan analyseras vid experimentell slutpunkt genom detaljerad 3D-konfokalanalys.
Kycklingembryot har varit ett idealiskt modellsystem för studier av ryggradsdjurens utveckling, särskilt för experimentella manipulationer. Användningen av kycklingembryot har utvidgats för att studera bildandet av humant glioblastom (GBM) hjärntumörer in vivo och tumörcellernas invasivitet i omgivande hjärnvävnad. GBM-tumörer kan bildas genom injektion av en suspension av fluorescerande märkta celler i E5-mellanhjärnan (optisk tektum) ventrikel i ovo.
Beroende på GBM-cellerna bildas kompakta tumörer slumpmässigt i ventrikeln och inom hjärnväggen, och grupper av celler invaderar hjärnväggsvävnaden. Tjocka vävnadssnitt (350 μm) av fast E15 tecta med tumörer kan immunfärgas för att avslöja att invaderande celler ofta migrerar längs blodkärlen när de analyseras genom 3D-rekonstruktion av konfokala z-stackbilder. Levande E15 mellanhjärna och framhjärnskivor (250-350 μm) kan odlas på membraninsatser, där fluorescerande märkta GBM-celler kan införas på icke-slumpmässiga platser för att tillhandahålla ex vivo-samkulturer för att analysera cellinvasion, som också kan inträffa längs blodkärl, under en period av cirka 1 vecka. Dessa ex vivo-samkulturer kan övervakas med widefield eller konfokal fluorescens time-lapse-mikroskopi för att observera levande cellbeteende.
Samodlade skivor kan sedan fixeras, immunfärgas och analyseras med konfokalmikroskopi för att avgöra om invasionen inträffade längs blodkärl eller axoner. Dessutom kan samodlingssystemet användas för att undersöka potentiella cell-cellinteraktioner genom att placera aggregat av olika celltyper och färger på olika exakta platser och observera cellrörelser. Läkemedelsbehandlingar kan utföras på ex vivo-kulturer , medan dessa behandlingar inte är kompatibla med in ovo-systemet . Dessa två kompletterande tillvägagångssätt möjliggör detaljerade och exakta analyser av humant GBM-cellbeteende och tumörbildning i en mycket manipulerbar ryggradsdjurs hjärnmiljö.
In vitro-studier av cancercellsbeteenden används ofta för att dissekera potentiella mekanismer som fungerar under det mer komplexa beteendet som observeras under tumörbildning och cellinvasion i in vivo xenograftmodeller. Till exempel, med glioblastom (GBM), in vitro-studier har avslöjat mekanismer för hur L1CAM potentiellt fungerar under tumörbildning och hjärninvasion i en ny chick embryo xenograft hjärntumör modell 1,2,3,4,5. Även om in vitro- och in vivo-experiment kompletterar varandra på användbara sätt, lämnar de ett betydande gap i hur resultaten kan korreleras. Till exempel är mekanistiska analyser av GBM-cellmotilitet på en maträtt en mycket artificiell situation, och in vivo xenograftmodeller kan bara avslöja statiska tidpunkts- eller slutpunktsanalyser av tumörbildning och cellbeteende. In vivo-studier med antingen gnagare eller kycklingembryon lämpar sig inte lätt för att övervaka cellbeteende medan cellerna invaderar hjärnvävnad i dessa xenograftmodeller. Ändå har xenograftmodellen för kycklingembryo visat att adhesionsproteinet L1CAM spelar en stimulerande roll i den invasiva förmågan hos humana T98G GBM-celler 2,5.
En lämplig lösning på detta problem kan nås genom att överbrygga både in vivo- och in vitro-metoder med hjälp av en organotypisk hjärnskivodlingsmodell, kallad ex vivo-modell. I denna ex vivo-modell kan levande hjärnvävnad bibehållas vid en tjocklek av flera hundra mikron i upp till några veckor, vilket gör det möjligt att implantera cancerceller, observera deras beteende i verklig vävnad över tid och sedan utföra en mer detaljerad marköranalys vid experimentets slutpunkt.
En populär organotypisk skivodlingsmetod har varit att odla en flera hundra mikron tjock hjärnskiva ovanpå ett genomskinligt eller transparent poröst membran, vilket lämnar vävnaden utsatt för luft, men ändå tillåter näringsmedier att upprätthålla vävnaden under membranet (se Stoppini et al.6). Olika varianter av denna metod har använts för olika studier, inklusive användning av olika medier eller olika membraninsatser. Olika membraninsatser inkluderar en 30 mm diameter, porös (0,4 μm) membraninsats i en 35 mm odlingsskål6 och cellodlingsinsatser (0,4 μm) för 6-brunnsplattor7. Olika medier inkluderar 50% MEM / HEPES + 25% värmeinaktiverat hästserum + 25% Hanks balanserad saltlösning (HBSS)8, 50% reducerat serummedia + 25% hästserum + 25% HBSS9, liksom andra. Om ett genomskinligt eller transparent membran används tillsammans med fluorescerande märkta GBM-celler, kan sådana kulturer avbildas underifrån med hjälp av ett inverterat widefield eller konfokalt fluorescensmikroskop 10,11,12,13,14,15.
Medan många di vivo ortotopiska hjärntumörxenograft och ex vivo organotypiska hjärnskivodlingsmodeller har etablerats med gnagare, som nämnts ovan, har kycklingembryot (Gallus gallus) underutnyttjats för dessa ändamål. Kycklingembryot har dock visat sig kunna användas som en in vivo ortotopisk xenograftmodell för studier av både humant och råttgliominvasion 1,2,5. Xenotransplanterade celler i kycklingembryohjärnor har uppvisat invasionsmönster som liknar dem som observerats i gnagarmodeller, vilket ytterligare stöder användningen av kycklingembryon som en in vivo-modell för GBM-tumörcellanalys. Chickembryon är också billiga, kan lättare underhållas än gnagare (dvs. i sina äggskal i en laboratorieinkubator) och är mycket lättare att arbeta med, vilket gör dem till ett attraktivt alternativ för kortvariga GBM-studier in vivo. En ny artikel har beskrivit användningen av kycklingembryo hjärnskivkulturer för bildning och tillväxt av axoner under normal hjärnutveckling där skivorna var livskraftiga i minst 7 dagar16. Användningen av sådana kycklingembryo hjärnskivkulturer för ex vivo-analys av GBM-cellbeteende i en vävnadsmiljö saknas dock. I denna artikel beskrivs både transplantation av humana GBM-celler och GBM-stamceller (GSC) i den tidiga kycklingembryohjärnan di vivo, liksom införandet av GBM-celler på levande kycklingembryo-hjärnskivkulturer ex vivo. Några representativa exempel på de resulterande tumörerna och cellinvasionsmönstren erhållna från dessa preparat tillhandahålls också.
Kritiska steg i protokollet för injektion av celler i mellanhjärnan (optisk tektum) ventrikel inkluderar att inte skada blodkärlen i det korioallantoiska membranet i ägget eller omger embryot före och under injektionen, även om amnionmembranet omedelbart omger embryot kan dras försiktigt och hållas för att placera huvudet när cellerna injiceras i mitthjärnan. Amnionen är relativt tuff och kan dras med fina pincett för att placera huvudet och hålla det stadigt med ena handen, för injektion av celler med den andra handen i optisk tektum, som är den stora, runda strukturen i mitten av hjärnan. I allmänhet varierar livskraften hos injicerade embryon från 25% till 75%, beroende på okända faktorer, och praktiskt taget varje embryo som överlever innehåller åtminstone en liten tumör i optisk tektum. Kritiska steg för att generera livskraftiga hjärnskivor inkluderar blotting av vävnaden av överflödig vätska så att agarosen fäster vid hjärnan under skivning och för att hålla vävnad och skivor kalla tills de placeras på membraninsatsen. Eftersom olika celltyper bildar sfäroider olika (i hastighet och storlek), bör den pläterade celldensiteten på poly-HEMA-plattor och tiden före skörd sfäroider optimeras för varje celltyp.
Arbetet här har inte varit föremål för en formell longitudinell studie av hjärnskivans livskraft. Yang et al. använde kycklingembryo hjärnskivkulturer liknande de som används här och visade god livskraft hos skivorna i minst 7 dagar16. Tidigare arbete visade att när OT-vävnad hölls i suboptimala medier uppträdde många pyknotiska kärnor i vävnaden, vilket inte förekom i skivorna i arbetet här. Dessutom, när skivor degenererar under suboptimala förhållanden, fragmenteras blodkärlen och visas som rader av lamininpositiva sfärer (visas inte). Således, även om livskraften här inte har kontrollerats med metoder som elektrofysiologi eller aktivt kaspas-3-uttryck, uppträdde ingen av indikatorerna för celldöd som sågs under suboptimala odlingsförhållanden här.
OT har fokuserats på för in vivo hjärntumörexperiment eftersom det är den lättast injicerade regionen med den största ventrikeln. Vid E5, som är den senaste dagen som embryot är tillräckligt litet för att förbli tillgängligt ovanpå äggulan, måste injektioner göras i en kammare, eftersom alla hjärnregioner inte är något annat än en tunn ventrikulär zon. Ändå resulterar dessa injektioner framgångsrikt i inbäddade tumörer med celler som invaderar hjärnparenkymet. Ibland finns resulterande tumörer i framhjärnan eller cerebellum, men detta är inte vanligt. Ex vivo-skivor av E15 optic tectum har främst använts för experiment här, så att ex vivo-samodlingsresultaten kan korreleras med injektionsexperimenten in vivo . Skivor i framhjärnan är emellertid också lämpliga och har en större yta och en mycket tunn kammare jämfört med optisk tektum, vilket kan göra framhjärnan mer lämplig för ex vivo-samkulturer som inte korreleras med in vivo-injektioner .
Det har här visats att in vivo-injektioner , följt av vävnadsfixering, vibrerande vävnadssnittning och immunfärgning för laminin och andra markörer, resulterade i högupplösta bilder av GBM-celler och GSC i hjärnvävnad i närheten av blodkärl. Möjligheten att bestämma sambanden mellan tumörceller och blodkärl underlättades avsevärt genom att skapa 3D-volymrenderingar från z-staplar av konfokala optiska sektioner med hjälp av konfokalprogramvaran och tillverkarens instruktioner. Time-lapse-avbildning med widefield fluorescensmikroskopi av GFP-, mCherry- och DiD-märkta celler var möjlig; Migrerande celler som var i närheten av de starkt fluorescerande sfäroiderna doldes emellertid ibland av “glöd” från sfäroiden. Denna oönskade effekt kan minimeras något genom att noggrant justera exponeringstiderna för insamling av widefield-bilder. Time-lapse-avbildning med konfokala z-staplar över tid (4D) eliminerade glöden utanför fokus från sfäroiderna och resulterade i skarpt definierade migrerande celler med mörk bakgrund. Detta beskrevs inte i protokollet, men utfördes på samma sätt som widefield time-lapse imaging, som utfördes medan hjärnskivor var på de transparenta membraninsatserna i en 6-brunns plastplatta. Även om konfokal time-lapse-avbildning resulterar i markant tydligare bilder av enskilda celler och deras beteende, är ett flerpunkts time-lapse-experiment som samlar z-staplar med 10 z-plan / punkt, med 10 minuters intervall under en 20-timmarsperiod, en omfattande användning av skanningshuvudets galvanometrar. Eftersom detta avsevärt kan minska galvanometrarnas livslängd används denna metod klokt.
Även om kycklingembryosystemet är mycket lämpligt för både di vivo-injektion och ex vivo-samodlingsexperiment som undersöker GBM-cellbeteende, finns det flera begränsningar för detta modellsystem. Som med alla xenograftsystem är miljön där mänskliga celler implanteras inte den mänskliga hjärnan, men GBM-cellbeteende verkar efterlikna det i gnagarmodeller och hos mänskliga patienter. Efter att ha utfört di vivo-injektionsexperiment på E5 tillåts tumörer normalt bildas i 10 dagar fram till E15. Detta är uppenbarligen inte tillräckligt med tid för att studera alla aspekter av tumörgenes och cellinvasion. Det har emellertid visats här att solida tumörer bildas i hjärnparenkymet, celler interagerar och omorganiserar sig inom tumören, och betydande hjärninvasion sker både längs blodkärl och diffust inom denna relativt korta tidsperiod. En annan begränsning för in vivo chick embryo systemet är att det inte är lämpligt för läkemedel eller andra behandlingar på grund av den stora äggula och extraembryonala cirkulationssystemet som fungerar under kycklingembryoutveckling. Topiska flytande läkemedelsbehandlingar skulle resultera i en mycket variabel och okänd koncentration i hjärnan på grund av diffusion bort från embryot till den mycket större äggula massan. På samma sätt skulle intravenös injektion av läkemedel i det mycket känsliga extraembryonala cirkulationssystemet läcka eller diffundera ut ur blodkärlen och också resultera i okända koncentrationer i hjärnan. Detta är en av de främsta anledningarna till att ex vivo-skivodlingsmetoden antogs – så att inte bara cellbeteende kunde observeras och spåras via time-lapse-mikroskopi, utan också så att behandlingar som har lyckats förändra GBM-cellbeteende i en maträtt4 kunde testas i en mer relevant hjärnvävnadsmiljö.
Utvecklingen av chick embryo orthotopic brain tumor model system ses som ett betydande tillskott till de system och verktyg som finns tillgängliga för studier av GBM tumörbildning och invasivt cellbeteende. Befruktade kycklingägg kommer sannolikt att vara lättillgängliga i de flesta områden, de är billiga jämfört med gnagare, det finns inga djurvårdskostnader, embryon är mycket motståndskraftiga och resistenta mot infektion (dvs. det mesta arbetet görs på en bänkskiva), embryona är mycket manipulerbara och kan odlas i skallös kultur19, och kycklingembryon betraktas inte som ryggradsdjur och kräver därför inte IACUC-godkännande enligt NIH-riktlinjer (institutionella krav kan variera). Således gör dessa flera fördelar kycklingembryosystemet mycket attraktivt om man begränsar sina frågor och experiment till de som faller inom dess begränsningar. Flera GBM-cellstudier har utförts av andra med hjälp av kycklingembryot, men dessa har nästan uteslutande utnyttjat det korioallantoiska membranet (CAM) i embryot 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 och lemknopp 30, och inte hjärnan. Det har också kommit en rapport som implanterar medulloblastom i kycklinghjärnan på E231. Utan tvekan bör användningen av kycklingembryot som ett ortotopiskt xenograftmodellsystem, som beskrivs här, ge resultat som är mycket mer meningsfulla för human GBM-tumörbiologi än studier med CAM.
Även om dessa studier bara har börjat utnyttja modellsystemet för hjärntumörer i kycklingembryon för studier av humant GBM-cell- och GSC-beteende, hoppas man att andra kommer att utöka användningsområdena och hitta ytterligare potentiella tillämpningar. Man kan tänka sig att detta system inte bara kommer att avslöja mekanismer som reglerar GBM-tumörbildning och cellbeteende, utan också kommer att möjliggöra preklinisk testning av specifika läkemedel och substanser på specifika patienters celler. Till exempel, om hjärnskivkulturer inrättades i förväg, kunde tumörceller, bitar från kirurgiska tumörresektioner eller patienthärledda GBM-organoider32 placeras direkt i ex vivo-samodling , och olika behandlingar kunde bedömas på några dagar. På liknande sätt kan dissocierade patientceller injiceras direkt i E5-mellanhjärnor i ovo för att bedöma deras förmåga att bilda tumörer och invadera hjärnparenkym. Förhoppningen är därför att beskrivningarna av metoderna och representativa resultat här kommer att underlätta och uppmuntra till ökad användning av detta mycket underutnyttjade system för hjärncancerforskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades delvis av ett bidrag till D.S.G. från National Cancer Institute (R03CA227312) och av ett generöst bidrag från Lisa Dean Moseley Foundation. Levande GBM-prover erhölls med patientens samtycke genom Tissue Procurement Center vid Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Finansiering till A.R. tillhandahölls av National Center for Research Resources och National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Sommarforskarstipendier till N.P., A.L., Z.W. och KS tillhandahölls av University of Delaware Undergraduate Research Program.
1 cm x 1 cm square hole paper punch | Birabira | N/A | |
1 mm biopsy punch pen | Robbins Instruments | 20335 | |
6 well insert plate (Corning Transwell) | Millipore Sigma | CLS3450 | |
9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
24 well plate | Corning Costar | 3526 | |
50 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-9 | |
Agar | Fisher BioReagents | BP1423-500 | for embedding fixed brains |
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-605-146 | |
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-146 | |
Aluminum foil | ReynoldsWrap | N/A | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A-9518 | |
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19622 | |
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53386 | |
anti-laminin monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
B27 supplement without vitamin A | GIBCO | 17504-044 | |
bisbenzimide (Hoechst 33258) | Sigma-Aldrich | B2883 | nuclear stain |
Cell culture incubator | Forma | standard humidified CO2 incubator | |
Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Confocal microscope | Nikon Instruments | C2si+ | With custom-made cell incubator chamber |
Confocal microscope objective lenses | Nikon Instruments | Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging | |
Confocal microscope software | Nikon Instruments | NIS Elements | Version 5.2 |
Curved foreceps | World Precision Intruments | 504478 | |
Curved scissors | Fine Science Tools | ||
Curved spatula | Fisher Scientific | 14-375-20 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | KG-585 12R | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
DiD far red fluorescent dye | Invitrogen | V22887 | Vybrant DiD |
DMEM | Sigma Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Sigma Aldrich | D8437 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
egg incubator | Humidaire | ||
electrical tape (10 mil thick/254 µm) | Scotch | N/A | |
Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
Fast green FCF dye | Avocado Research Chemicals | 16520 | |
FBS | Gemini Bio-products | 900-108 | |
filter paper | Fisher Scientific | ||
Gauze | Dynarex | 3353 | |
Glass Capillaries for microinjection | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP228-1 | for mounting media |
GSCs (human glioblastoma stem cells) | Not applicable | Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector. Cells used were between passage 10 and 30. | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
Hemacytometer | Hausser scientific | ||
Heparin | Fisher Scientific | BP2524-100 | |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
Horse Serum (HI) | Gibco | 26050-088 | |
Human FGF-2 | BioVision | 4037-1000 | |
Human TGF-α | BioVision | 4339-1000 | |
Inverted phase contrast microscope | Nikon Instruments | TMS | for routine viewing of cultured cells |
KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
Laboratory film | Parafilm | ||
Labquake Shaker | LabIndustries | T400-110 | |
L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-products | 400-110 | |
Low-melt agarose | Fisher Scientific | BP1360 | for embedding live brains |
Matrix | Corning Matrigel | 354234 | |
Medium 199 | GIBCO | 11150-059 | |
MEM | Corning | 10-010-CV | |
Metal vibratome block | |||
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) | Fisherbrand | ||
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) | Gilson | ||
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) | Fisherbrand | 12544A | |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
NaH2PO4 + H2O | Fisher Scientific | S369 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | 526-M | |
N-propyl gallate | Sigma Aldrich | P3130 | for mounting media |
Parafilm | Parafilm | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
Pencil | |||
Plain Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Plastic 35 mm Petri dish | Becton Dickinson | 351008 | |
pneumatic picopump | World Precision Intruments | PV830 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | P-3932 | |
razor blade- double edge | PACE | for cutting fixed brain slices | |
sapphire knife | Delaware Diamond Knives | for cutting live brain slices | |
Scalpel | TruMed | 1001 | |
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
Specimen chamber for vibratome | custom-made | ||
Stereo Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | Equipped with epifluorescence |
straight foreceps | World Precision Intruments | 500233 | |
straight scissors | Fine Science Tools | ||
Sucrose | Mallinckrodt | 7723 | |
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) | Nikon Instruments | TE2000-E | With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006) |
Tissue culture dish polystyrene 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | for cell culturing |
Tissue culture dish polystyrene 60 mm | Becton Dickinson | 353004 | for cell culturing |
Transfer pipette | American Central Scientific Co. | FFP011 | |
Transparent tape | Scotch | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T-8787 | |
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
U-118 MG human GBM cell line | ATCC | HTB-15 | Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry. Passage numbers are unknown. |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-07532-40 | "Air Cadet" |
Vibrating tissue slicer | Vibratome | 3000 | for cutting live and fixed brain slices |