Рабочий процесс оптимизации рецептуры липидных наночастиц (LNP) с использованием разработанных экспериментов по смесевым процессам и самовалидированных ансамблевых моделей (SVEM)

Summary

Этот протокол обеспечивает подход к оптимизации рецептуры по смешанным, непрерывным и категориальным факторам исследования, который сводит к минимуму субъективный выбор при построении экспериментального дизайна. На этапе анализа используется эффективная и простая в использовании процедура подгонки моделирования.

Abstract

Мы представляем подход к оптимизации составов липидных наночастиц (LNP) в стиле Quality by Design (QbD), направленный на то, чтобы предложить ученым доступный рабочий процесс. Неотъемлемое ограничение в этих исследованиях, где молярные соотношения ионизируемых, вспомогательных и ПЭГ-липидов должны составлять до 100%, требует специализированных методов проектирования и анализа для учета этого ограничения смеси. Сосредоточив внимание на липидных и технологических факторах, которые обычно используются при оптимизации конструкции LNP, мы предлагаем шаги, которые позволяют избежать многих трудностей, которые традиционно возникают при планировании и анализе экспериментов со смесевыми процессами, используя проекты заполнения пространства и используя недавно разработанную статистическую основу самовалидированных ансамблевых моделей (SVEM). В дополнение к созданию оптимальных формулировок-кандидатов, рабочий процесс также создает графические сводки подходящих статистических моделей, которые упрощают интерпретацию результатов. Вновь выявленные препараты-кандидаты оцениваются с помощью подтверждающих прогонов и, при необходимости, могут быть проведены в контексте более всестороннего исследования второй фазы.

Introduction

Составы липидных наночастиц (LNP) для систем доставки генов in vivo обычно включают четыре составляющих липида из категорий ионизируемых, хелперных и ПЭГ-липидов ^1,2,3. Независимо от того, изучаются ли эти липиды отдельно или одновременно с другими несмешанными факторами, эксперименты для этих составов требуют «смешанных» дизайнов, потому что при наличии рецептуры-кандидата увеличение или уменьшение соотношения любого из липидов обязательно приводит к соответствующему уменьшению или увеличению суммы соотношений трех других липидов.

Например, предполагается, что мы оптимизируем формулировку LNP, в которой в настоящее время используется заданный рецепт, который будет рассматриваться в качестве эталона. Цель состоит в том, чтобы максимизировать эффективность LNP, одновременно стремясь свести к минимуму средний размер частиц. Факторами исследования, которые варьируются в эксперименте, являются молярные соотношения четырех составляющих липидов (ионизируемый, холестерин, DOPE, PEG), соотношение N: P, скорость потока и ионизируемый тип липида. Ионизируемые и вспомогательные липиды (включая холестерин) могут варьироваться в более широком диапазоне молярного соотношения, 10-60%, чем ПЭГ, которое будет варьироваться от 1 до 5% на этом рисунке. Рецептура эталонной рецептуры и диапазоны других факторов и их степень детализации округления указаны в дополнительном файле 1. В этом примере ученые могут выполнить 23 прогона (уникальные партии частиц) за один день и хотели бы использовать его в качестве размера выборки, если он соответствует минимальным требованиям. Смоделированные результаты этого эксперимента представлены в дополнительном файле 2 и дополнительном файле 3.

Рампадо и Peer⁴ опубликовали недавнюю обзорную статью на тему разработанных экспериментов по оптимизации систем доставки лекарств на основе наночастиц. Kauffman et ^al.5 рассмотрели оптимизационные исследования LNP с использованием дробных факторных и окончательных скрининговых дизайнов⁶; Однако эти типы конструкций не могут приспособиться к ограничению смеси, не прибегая к использованию неэффективных «переменных слабости»7, и обычно не используются при наличии коэффициентов смешивания ^7,8. Вместо этого для экспериментов с процессами смешивания традиционно используются «оптимальные конструкции», способные включать ограничение смеси⁹. Эти проекты нацелены на заданную пользователем функцию исследуемых факторов и являются оптимальными (в одном из нескольких возможных смыслов) только в том случае, если эта функция фиксирует истинную взаимосвязь между исследуемыми факторами и реакциями. Следует отметить, что в тексте проводится различие между “оптимальными проектами” и “оптимальными формулировками-кандидатами”, причем последние относятся к наилучшим формулировкам, определенным статистической моделью. Оптимальные конструкции имеют три основных недостатка для экспериментов со смесевыми процессами. Во-первых, если ученый не сможет предвидеть взаимодействие исследуемых факторов при определении целевой модели, то результирующая модель будет предвзятой и может привести к неполноценным формулировкам-кандидатам. Во-вторых, оптимальные конструкции размещают большую часть прогонов на внешней границе факторного пространства. В исследованиях LNP это может привести к большому количеству потерянных прогонов, если частицы не образуются правильно при любых экстремальных значениях липидов или технологических настроек. В-третьих, ученые часто предпочитают проводить экспериментальные прогоны на внутренней стороне факторного пространства, чтобы получить независимое от модели ощущение поверхности отклика и наблюдать за процессом непосредственно в ранее неисследованных областях факторного пространства.

Альтернативный принцип проектирования заключается в том, чтобы нацелиться на приблизительное равномерное покрытие пространства факторов (ограниченного смесью) с помощью конструкции, заполняющей пространство¹⁰. Эти проекты приносят в жертву некоторую экспериментальную эффективность по сравнению с оптимальными проектами⁹ (предполагая, что все пространство факторов приводит к действительным формулировкам), но представляют несколько преимуществ в компромиссе, которые полезны в этом приложении. Конструкция заполнения пространства не делает никаких априорных предположений о структуре поверхности отклика; Это дает ему гибкость для фиксации непредвиденных взаимосвязей между факторами исследования. Это также упрощает создание проекта, так как не требует принятия решений о том, какие регрессионные термины добавлять или удалять по мере корректировки желаемого размера прогона. Когда некоторые точки проектирования (рецепты) приводят к неудачным составам, проекты, заполняющие пространство, позволяют моделировать границу отказа по исследуемым факторам, а также поддерживать статистические модели для ответов исследования на успешные комбинации факторов. Наконец, внутреннее покрытие факторного пространства позволяет проводить независимое от модели графическое исследование поверхности отклика.

Для визуализации подпространства коэффициента смешивания эксперимента используется специализированный треугольный «тройной график». Рисунок 1 мотивирует такое использование: в кубе точек, где каждый из трех ингредиентов может находиться в диапазоне от 0 до 1, точки, которые удовлетворяют ограничению, согласно которому сумма ингредиентов равна 1, выделены красным цветом. Ограничение смеси на три ингредиента уменьшает допустимое пространство факторов до треугольника. В приложениях LNP с четырьмя ингредиентами смеси мы создаем шесть различных тройных графиков для представления пространства факторов путем построения двух липидов одновременно по оси «Другие», которая представляет сумму других липидов.

Рисунок 1: Области треугольных факторов. На графике, заполняющем пространство внутри куба, маленькие серые точки представляют составы, которые не согласуются с ограничением смеси. Более крупные красные точки лежат на треугольнике, вписанном в куб, и представляют собой составы, для которых выполняется ограничение смеси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В дополнение к факторам липидной смеси часто существует один или несколько факторов непрерывного процесса, таких как соотношение N:P, концентрация буфера или скорость потока. Могут присутствовать категориальные факторы, такие как ионизируемый липидный тип, вспомогательный липидный тип или буферный тип. Цель состоит в том, чтобы найти рецептуру (смесь липидов и настроек для технологических факторов), которая максимизирует некоторую меру активности и/или улучшает физико-химические характеристики, такие как минимизация размера частиц и PDI (индекс полидисперсности), максимизация процентной инкапсуляции и минимизация побочных эффектов, таких как потеря массы тела, в исследованиях in vivo . Даже если вы начинаете с разумного эталонного рецепта, может возникнуть интерес к повторной оптимизации с учетом изменения генетической полезной нагрузки или при рассмотрении изменений в технологических факторах или типах липидов.

Корнелл⁷ предоставляет окончательный текст по статистическим аспектам экспериментов со смесями и процессами смешивания, а Майерс и ^др.9 предоставляют отличное резюме наиболее актуальных тем проектирования и анализа смесей для оптимизации. Однако эти работы могут перегружать ученых статистическими деталями и специализированной терминологией. Современное программное обеспечение для проектирования и анализа экспериментов обеспечивает надежное решение, которое в достаточной степени поддержит большинство задач оптимизации LNP без необходимости обращения к соответствующей теории. В то время как более сложные или высокоприоритетные исследования по-прежнему выигрывают от сотрудничества со статистиком и могут использовать оптимальные, а не заполняющие пространство конструкции, наша цель состоит в том, чтобы повысить уровень комфорта ученых и стимулировать оптимизацию составов LNP, не прибегая к неэффективному однофакторному тестированию за раз (OFAT)¹¹ или просто соглашаясь на первую формулу, которая удовлетворяет спецификациям.

В этой статье представлен рабочий процесс, который использует статистическое программное обеспечение для оптимизации общей проблемы формулировки LNP, решая проблемы проектирования и анализа в том порядке, в котором они будут встречаться. Фактически, этот метод будет работать для общих задач оптимизации и не ограничивается LNP. Попутно рассматривается несколько общих вопросов, которые возникают, и даются рекомендации, основанные на опыте и результатах моделирования¹². Недавно разработанная структура самовалидированных ансамблевых моделей (SVEM)¹³ значительно улучшила хрупкий подход к анализу результатов экспериментов со смесевыми процессами, и мы используем этот подход для обеспечения упрощенной стратегии оптимизации рецептуры. В то время как рабочий процесс построен в общем виде, которому можно было бы следовать с помощью других программных пакетов, JMP 17 Pro уникален тем, что предлагает SVEM вместе с графическими инструментами сводки, которые, как мы обнаружили, необходимы для упрощения запутанного анализа экспериментов со смесевыми процессами. В результате в протоколе также содержатся инструкции, специфичные для JMP.

SVEM использует ту же основу модели линейной регрессии, что и традиционный подход, но он позволяет нам избежать утомительных модификаций, необходимых для соответствия «полной модели» эффектов-кандидатов, используя либо прямой выбор, либо базовый подход с штрафной выборкой (Лассо). Кроме того, SVEM обеспечивает улучшенную подгонку «уменьшенной модели», которая сводит к минимуму вероятность включения шума (процесс плюс аналитическая дисперсия), который появляется в данных. Он работает путем усреднения прогнозируемых моделей, полученных в результате многократного перевзвешивания относительной важности каждого прогона в модели 13,14,15,16,17,18. SVEM предоставляет основу для моделирования экспериментов со смесевыми процессами, которая не только проще в реализации, но и традиционная одноразовая регрессия, и дает более качественные кандидаты на оптимальную рецептуру^12,13. Математические детали SVEM выходят за рамки данной статьи, и даже беглое резюме, выходящее за рамки соответствующего обзора литературы, отвлекло бы внимание от его главного преимущества в этом приложении: оно обеспечивает простую, надежную и точную процедуру «нажми и работай» для практиков.

Представленный рабочий процесс согласуется с подходом Quality by Design (QbD)¹⁹ к фармацевтической разработке²⁰. Результатом исследования будет понимание функциональной взаимосвязи, которая связывает атрибуты материала и параметры процесса с критическими атрибутами качества (CQA)²¹. Daniel et ^al.22 обсуждают использование фреймворка QbD специально для производства платформы РНК: наш рабочий процесс может быть использован в качестве инструмента в этой структуре.

Protocol

Эксперимент, описанный в разделе «Репрезентативные результаты», был проведен в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, а процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными нашим Комитетом по уходу за животны?…

Representative Results

Этот подход был подтвержден для обоих широко классифицированных типов липидов: MC3-подобных классических липидов и липидоидов (например, C12-200), обычно полученных из комбинаторной химии. По сравнению с эталонной формулой LNP, разработанной с использованием метода «один фактор за раз» (OFAT), ?…

Discussion

Современное программное обеспечение для разработки и анализа экспериментов со смесевыми процессами позволяет ученым улучшать свои составы липидных наночастиц в структурированном рабочем процессе, который позволяет избежать неэффективных экспериментов с OFAT. Недавно разработанный ?…

Materials

JMP Pro 17.1

JMP Statistical Discovery LLC