設計された混合プロセス実験と自己検証アンサンブルモデル(SVEM)を使用した脂質ナノ粒子(LNP)製剤最適化のワークフロー

Summary

このプロトコルは、実験計画構成における主観的な選択を最小限に抑える、混合、連続、およびカテゴリカル研究要因に対する定式化最適化へのアプローチを提供します。解析フェーズでは、効果的で使いやすいモデリングフィッティング手順が採用されます。

Abstract

脂質ナノ粒子(LNP)製剤を最適化するためのクオリティ・バイ・デザイン(QbD)スタイルのアプローチを提示し、科学者にアクセス可能なワークフローを提供することを目指しています。イオン化性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG脂質のモル比を合計すると最大100%でなければならないこれらの研究に固有の制限により、この混合物の制約に対応するための特殊な設計および分析方法が必要です。LNP設計の最適化で一般的に使用される脂質とプロセス因子に焦点を当て、空間充填設計を採用し、最近開発された自己検証アンサンブルモデル(SVEM)の統計的フレームワークを利用することにより、混合プロセス実験の設計と分析で従来発生する多くの困難を回避するステップを提供します。ワークフローは、候補となる最適な定式化の作成に加えて、結果の解釈を簡素化する適合統計モデルのグラフィカルな要約も構築します。新たに同定された候補製剤は、確認ランで評価され、オプションで、より包括的な第2相試験のコンテキストで実施することができます。

Introduction

in vivo遺伝子送達システム用の脂質ナノ粒子(LNP)製剤は、一般に、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG脂質のカテゴリーからの4つの構成脂質を含む¹、^2、3。これらの脂質が単独で研究されているか、他の非混合因子と同時に研究されているかにかかわらず、これらの製剤の実験では、候補製剤が与えられた場合、脂質のいずれか1つの比率を増減すると、必然的に他の3つの脂質の比率の合計が対応する減少または増加するため、「混合」設計が必要です。

説明のために、ベンチマークとして扱われるセットレシピを現在使用しているLNP製剤を最適化していると想定されています。目標は、LNPの効力を最大化すると同時に、二次的に平均粒子サイズを最小限に抑えることを目指すことです。実験で変化する研究要因は、4つの構成脂質(イオン化可能、コレステロール、DOPE、PEG)のモル比、N:P比、流速、およびイオン化可能な脂質タイプです。イオン化性脂質およびヘルパー脂質(コレステロールを含む)は、PEGよりも広い範囲のモル比、10〜60%にわたって変化することが許容され、この図では1〜5%から変化する。ベンチマーク定式化レシピと他の要因の範囲、およびそれらの丸め粒度は、補足ファイル1で指定されています。この例では、科学者は1日に23回の実行(粒子の一意のバッチ)を実行でき、最小要件を満たしている場合はそれをサンプルサイズとして使用したいと考えています。この実験のシミュレーション結果は、補足ファイル2および補足ファイル3に記載されています。

RampadoとPeer⁴は、ナノ粒子ベースのドラッグデリバリーシステムの最適化のための設計された実験のトピックに関する最近のレビュー論文を発表しました。Kauffmanら⁵は、分数要因と決定的スクリーニング計画を用いたLNP最適化研究を検討しました⁶。ただし、これらのタイプの計画は、非効率的な「スラック変数」⁷の使用に頼らずに混合制約条件に対応することはできず、混合因子が存在する場合は通常使用されません^7,8。その代わりに、混合制約を組み込むことができる「最適設計」が、伝統的に混合プロセス実験⁹に使用される。これらの計画は、ユーザーが指定した分析因子の関数を対象としており、この関数が分析因子と応答の間の真の関係を捉える場合にのみ(考えられる多くの意味の1つで)最適です。本文には「最適設計」と「最適製剤候補」の区別があり、後者は統計モデルによって特定された最良の製剤を指すことに注意してください。最適設計には、混合プロセス実験の3つの主な欠点があります。第一に、科学者がターゲットモデルを指定するときに研究因子の相互作用を予測できない場合、結果として得られるモデルは偏りがあり、劣った候補定式化を生み出す可能性があります。第2に、最適計画では、ほとんどの実行が因子空間の外部境界に配置されます。LNP研究では、脂質またはプロセス設定の極端で粒子が正しく形成されない場合、これにより多数のランが失われる可能性があります。第三に、科学者は、モデルに依存しない応答曲面の感覚を得て、因子空間のこれまで未踏の領域でプロセスを直接観察するために、因子空間の内部で実験を実行することを好むことがよくあります。

別の設計原理は、空間充填計画¹⁰で(混合拘束)因子空間の近似一様被覆をターゲットにすることです。これらの計画は、最適計画⁹ と比較して実験効率をいくらか犠牲にしますが(因子空間全体が有効な定式化につながると仮定します)、このアプリケーションで有用なトレードオフでいくつかの利点を提供します。空間充填計画では、応答曲面の構造について 先験 的に仮定することはありません。これにより、分析因子間の予期しない関係を柔軟に把握できます。これにより、目的のランサイズを調整するときに追加または削除する回帰項を決定する必要がないため、計画生成も合理化されます。一部の計画点(レシピ)が定式化の失敗につながる場合、空間充填計画により、研究因子の破損境界をモデル化すると同時に、成功した因子の組み合わせに対する研究応答の統計モデルもサポートできます。最後に、因子空間の内部カバレッジにより、モデルに依存しない応答曲面のグラフィカルな探索が可能になります。

混合プロセス実験の混合因子部分空間を視覚化するために、特殊な三角形の「三角プロット」が使用されます。 図 1 は、3 つの成分がそれぞれ 0 から 1 の範囲に許容される点の立方体で、成分の合計が 1 に等しいという制約を満たす点が赤で強調表示されます。3つの成分に対する混合制約により、実現可能因子空間が三角形に減少します。4つの混合成分を使用するLNPアプリケーションでは、他の脂質の合計を表す「その他」軸に対して一度に2つの脂質をプロットすることにより、因子空間を表す6つの異なる三元プロットを生成します。

図1:三角因子領域。 立方体内の空間充填プロットでは、小さな灰色の点は混合拘束条件と矛盾する定式化を表します。大きな赤い点は、立方体内に内接する三角形上にあり、混合制約が満たされる定式化を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

脂質混合因子に加えて、N:P比、緩衝液濃度、流速などの1つ以上の連続プロセス因子が存在することがよくあります。イオン化可能な脂質タイプ、ヘルパー脂質タイプ、またはバッファータイプなどのカテゴリー的要因が存在し得る。目標は、効力の尺度を最大化し、および/または粒子サイズとPDI(多分散指数)の最小化などの物理化学的特性を改善する製剤(脂質とプロセス要因の設定の混合物)を見つけることです、カプセル化率の最大化、および副作用の最小化- in vivo 研究で体重減少など。妥当なベンチマークレシピから始める場合でも、遺伝的ペイロードの変化を考慮して、またはプロセス因子や脂質タイプの変化を考慮する場合は、再最適化に関心があるかもしれません。

Cornell⁷ は、混合および混合プロセス実験の統計的側面に関する決定的なテキストを提供し、Myersら9は、最適化のための最も関連性の高い混合設計および分析トピックの優れた^{要約を提供します。} ただし、これらの作業は、統計的な詳細と専門用語で科学者を過負荷にする可能性があります。実験の計画と分析のための最新のソフトウェアは、関連する理論に訴えることなく、ほとんどのLNP最適化問題を十分にサポートする堅牢なソリューションを提供します。より複雑で優先度の高い研究は、統計学者とのコラボレーションの恩恵を受け、スペース充填設計ではなく最適な設計を採用する可能性がありますが、私たちの目標は、科学者の快適性レベルを向上させ、非効率的な1ファクターアットアタイム(OFAT)テスト¹¹ に訴えたり、単に仕様を満たす最初の製剤に落ち着くことなく、LNP製剤の最適化を促進することです。

この記事では、統計ソフトウェアを利用して一般的なLNP定式化の問題を最適化し、設計と分析の問題に遭遇する順序で対処するワークフローを紹介します。実際、この方法は一般的な最適化問題に対して機能し、LNPに限定されません。 その過程で、発生するいくつかの一般的な質問に対処し、経験とシミュレーション結果に基づいた推奨事項を提供します¹²。最近開発された自己検証アンサンブルモデル(SVEM)¹³ のフレームワークは、混合プロセス実験の結果を分析するための他の脆弱なアプローチを大幅に改善し、このアプローチを使用して、製剤最適化のための簡素化された戦略を提供します。ワークフローは、他のソフトウェアパッケージを使用しても従うことができる一般的な方法で構築されていますが、JMP 17 Proは、混合プロセス実験の難解な分析を簡素化するために必要であることが判明したグラフィカルな要約ツールとともにSVEMを提供するという点でユニークです。その結果、JMP固有の命令もプロトコルで提供されます。

SVEMは、従来のアプローチと同じ線形回帰モデル基盤を採用していますが、前方選択またはペナルティ付き選択(なげなわ)ベースアプローチのいずれかを使用することで、候補効果の「フルモデル」に適合するために必要な面倒な変更を回避できます。さらに、SVEMは、データに現れるノイズ(工程と分析的分散)を組み込む可能性を最小限に抑える、改善された「縮小モデル」適合を提供します。これは、モデル¹³、14、^15、16、^17、18の各実行の相対的な重要度を繰り返し再重み付けした結果^、予測されたモデルを平均化することによって機能します。SVEMは、従来のシングルショット回帰よりも実装が容易で、より高品質の最適な製剤候補が得られる混合プロセス実験をモデル化するためのフレームワークを提供します^12,13。SVEMの数学的詳細はこのホワイトペーパーの範囲を超えており、関連する文献レビューを超えた大まかな要約でさえ、このアプリケーションの主な利点である、開業医にとってシンプルで堅牢で正確なクリックツーラン手順を可能にします。

提示されたワークフローは、医薬品開発に対するクオリティ・バイ・デザイン(QbD)¹⁹ アプローチと一致しています²⁰。研究の結果、材料属性とプロセスパラメータを臨界品質属性(CQA)²¹にリンクする機能的関係が理解されます。Daniel et ^al.22 は、RNAプラットフォーム生産に特化したQbDフレームワークの使用について議論しています:私たちのワークフローは、このフレームワーク内のツールとして使用できます。

Protocol

代表的な結果のセクションに記載されている実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施され、手順は、施設動物管理使用委員会(IACUC)によって確立されたガイドラインに従って実行されました。6〜8週齢の雌Balb/Cマウスを商業的に入手した。動物は、標準的な固形飼料と水を 自由摂取 し、湿度40〜60%、温度65-75°F(~18-23°C)で、12時間の明暗サイクルの標準条件下で飼育し…

Representative Results

このアプローチは、MC3様古典脂質とリピドイド(C12-200など)の両方に広く分類され、一般的にコンビナトリアルケミストリーに由来します。One Factor at a Time(OFAT)法を使用して開発されたベンチマークLNP製剤と比較して、当社のワークフローを通じて生成された候補製剤は、 図18のマウス肝ルシフェラーゼ測定値に示すように、対数スケールで4〜5倍の効力向上を示すことが…

Discussion

混合プロセス実験の設計と分析のための最新のソフトウェアにより、科学者は非効率的なOFAT実験を回避する構造化されたワークフローで脂質ナノ粒子製剤を改善できます。最近開発されたSVEMモデリングアプローチは、以前は無関係な統計的考察で科学者の注意をそらしていた可能性のある難解な回帰変更とモデル削減戦略の多くを排除します。結果が収集されると、SVEM分析フレームワーク?…

Materials

JMP Pro 17.1

JMP Statistical Discovery LLC