Analyse av fluorescerende fargede lipiddråper med 3D-rekonstruksjon for vurdering av leversteatose

Summary

Her demonstrerer vi en optimalisert BODIPY 493/503 fluorescensbasert protokoll for lipiddråpekarakterisering i levervev. Gjennom bruk av ortogonale projeksjoner og 3D-rekonstruksjoner muliggjør fluoroforen vellykket diskriminering mellom mikrovesikulær og makrovesikulær steatose og kan representere en komplementær tilnærming til de klassiske histologiske protokollene for vurdering av leversteatose.

Abstract

Lipiddråper (LD) er spesialiserte organeller som formidler lipidlagring og spiller en svært viktig rolle i å undertrykke lipotoksisitet og forhindre dysfunksjon forårsaket av frie fettsyrer (FAs). Leveren, gitt sin kritiske rolle i kroppens fettmetabolisme, er vedvarende truet av den intracellulære akkumuleringen av LD i form av både mikrovesikulær og makrovesikulær hepatisk steatose. Den histologiske karakteriseringen av LD er vanligvis basert på lipidløselige diazofargestoffer, for eksempel Oil Red O (ORO) farging, men en rekke ulemper hindrer konsekvent bruken av denne analysen med leverprøver. Mer nylig har lipofile fluoroforer 493/503 blitt populære for å visualisere og lokalisere LD på grunn av deres raske opptak og akkumulering i den nøytrale lipiddråpekjernen. Selv om de fleste applikasjoner er godt beskrevet i cellekulturer, er det mindre bevis som viser pålitelig bruk av lipofile fluoroforprober som et LD-bildebehandlingsverktøy i vevsprøver. Her foreslår vi en optimalisert bordipyrrometen (BODIPY) 493/503-basert protokoll for evaluering av LD i leverprøver fra en dyremodell av fettfattig diett (HFD) -indusert hepatisk steatose. Denne protokollen dekker leverprøvepreparering, vevssnitt, BODIPY 493/503-farging, bildeinnsamling og dataanalyse. Vi demonstrerer økt antall, intensitet, arealforhold og diameter av lever-LD ved HFD-fôring. Ved hjelp av ortogonale projeksjoner og 3D-rekonstruksjoner var det mulig å observere hele innholdet av nøytrale lipider i LD-kjernen, som fremsto som nesten sfæriske dråper. Videre var vi med fluoroforen BODIPY 493/503 i stand til å skille mikrovesikler (1 μm < d ≤ 3 μm), mellomliggende vesikler (3 μm 9 μm), noe som muliggjorde vellykket diskriminering av mikrovesikulær og makrovesikulær steatose. Samlet sett er denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserte protokollen et pålitelig og enkelt verktøy for hepatisk LD-karakterisering og kan representere en komplementær tilnærming til de klassiske histologiske protokollene.

Introduction

Lipiddråper (LD), klassisk sett på som energidepoter, er spesialiserte cellulære organeller som formidler lipidlagring, og de omfatter en hydrofob nøytral lipidkjerne, som hovedsakelig inneholder kolesterolestere og triglyserider (TG), innkapslet av et fosfolipidmonolag ^1,2,3.

LD-biogenese forekommer i endoplasmatisk retikulum (ER), som starter med syntesen av triacylglycerol (TAG) og sterolestere. Nøytrale lipider diffunderes mellom brosjyrene i ER-dobbeltlaget ved lave konsentrasjoner, men samles i oljelinser som vokser og knopper til nesten sfæriske dråper fra ER-membran når deres intracellulære konsentrasjon øker⁴. Deretter overføres proteiner fra ER-dobbeltlaget og cytosolen, spesielt perilipin (PLIN) proteinfamilien, til overflatene av LD-ene for å lette spirende 5,6,7,8,9.

Gjennom ny fettsyresyntese og LD-fusjon eller koalescens vokser LD til forskjellige størrelser. Følgelig varierer størrelsen og antallet LD-er betydelig på tvers av forskjellige celletyper. Små dråper (300-800 nm diameter), som er kjent som innledende LDs (iLDs), kan dannes av nesten alle celler⁴. Senere i LD-dannelsen er de fleste celler i stand til å konvertere noen iLD-er til større-ekspanderende LD-er (eLD-er >1 μm i diameter). Likevel har bare spesifikke celletyper, som adipocytter og hepatocytter, kapasitet til å danne gigantiske eller overdimensjonerte LD-er (opptil titalls mikrometer i diameter)^4,10.

LD spiller en svært viktig rolle i reguleringen av cellulær lipidmetabolisme, undertrykker lipotoksisitet og forhindrer ER-stress, mitokondriell dysfunksjon og til slutt celledød forårsaket av frie fettsyrer (FAs)^11,12,13,14. Videre har LDs også vært involvert i reguleringen av genuttrykk, viral replikasjonsproteinsekvestrasjon og membranhandel og signalering 15,16,17. Derfor er feilreguleringen av LD-biogenese et kjennetegn på kroniske sykdommer forbundet med metabolsk syndrom, fedme, type 2 diabetes mellitus (T2DM) og / eller arteriosklerose, for å nevne noen få^18,19,20.

Leveren, som et metabolsk knutepunkt, er for det meste ansvarlig for lipidmetabolismen ved å lagre og behandle lipider, og derfor er den konstant truet av lipotoksisitet²¹. Hepatisk steatose (HS) er et vanlig trekk ved en rekke progressive leversykdommer og er preget av overdreven intracellulær lipidakkumulering i form av cytosoliske LDs som i siste instans kan føre til metabolsk dysfunksjon i leveren, betennelse og avanserte former for ikke-alkoholholdig fettleversykdom^22,23,24,25. HS oppstår når graden av fettsyreoksidasjon og eksport som triglyserider i svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL) er lavere enn graden av hepatisk fettsyreopptak fra plasma og de novo fettsyresyntese²⁶. Den hepatiske akkumuleringen av lipider forekommer ofte i to former – mikrovesikulær og makrovesikulær steatose – og disse viser forskjellige cytoarkitektoniske egenskaper²⁷. Vanligvis er mikrovesikulær steatose preget av tilstedeværelsen av små LD-er spredt over hele hepatocytten med kjernen plassert sentralt, mens makrovesikulær steatose er preget av tilstedeværelsen av en enkelt stor LD som opptar størstedelen av hepatocytten, skyver kjernen til periferien^28,29. Spesielt er disse to typer steatose ofte funnet sammen, og det er fortsatt uklart hvordan disse to LD-mønstrene påvirker sykdomspatogenesen, da bevis fortsatt er inkonsekvent^31,32,33,34. Likevel er en slik type analyse ofte ansatt som en “referansestandard” i prekliniske og kliniske studier for å forstå LDs dynamiske oppførsel og karakterisere hepatisk steatose 29,34,35,36.

Leverbiopsier, gullstandarden for diagnostisering og gradering av HS, vurderes rutinemessig ved histologisk hematoksylin og eosin (H&E) analyse, hvor lipiddråper vurderes som ufargede vakuoler i H&E-fargede leverseksjoner³⁷. Selv om det er akseptabelt for evaluering av makrovesikulær steatose, begrenser denne typen farging generelt vurderingen av mikrovesikulær steatose³⁸. Lipidløselige diazofargestoffer, som Oil Red O (ORO), kombineres klassisk med lysfeltmikroskopi for å analysere intracellulære lipidlagre, men disse har fortsatt en rekke ulemper: (i) bruk av etanol eller isopropanol i fargeprosessen, noe som ofte forårsaker forstyrrelse av de opprinnelige LD-ene og sporadisk fusjon til tross for at cellene er fikset³⁹; (ii) den tidkrevende naturen, da ORO-oppløsning krever ny pulveroppløsning og filtrering på grunn av begrenset holdbarhet, og dermed bidrar til mindre konsistente resultater; (iii) og det faktum at ORO flekker mer enn bare lipiddråper og ofte overvurderer hepatisk steatose³⁸.

Følgelig har cellepermeable lipofile fluoroforer, som Nilrød, blitt brukt i enten levende eller faste prøver for å overvinne noen av de nevnte begrensningene. Imidlertid begrenser den ikke-spesifikke karakteren av cellulær lipidorganellmerking gjentatte ganger LD-vurderinger⁴⁰. Videre varierer de spektrale egenskapene til Nile Red i henhold til miljøets polaritet, noe som ofte kan føre til spektrale skift⁴¹.

Den lipofile fluorescerende sonden 1,3,5,7,8-pentametyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (eksitasjonsbølgelengde: 480 nm; utslippsmaksimum: 515 nm; BODIPY 493/503) utviser hydrofobisitetsegenskaper som tillater raskt opptak av intracellulære LD-er, akkumuleres i lipiddråpekjernen og deretter avgir lysegrønn fluorescens¹². I motsetning til Nile Red er BODIPY 493/503 ufølsom for miljøpolariteten og har vist seg å være mer selektiv, da den viser høy lysstyrke for LD-bildebehandling. For å flekke nøytrale LD-er, kan dette fargestoffet brukes i levende eller faste celler og vellykket kombinert med andre farge- og / eller merkingsmetoder⁴². En annen fordel med fargestoffet er at det krever liten innsats å plassere i en løsning og er stabil, og eliminerer dermed behovet for å forberede det til hvert eksperiment⁴². Selv om BODIPY 493/503-sonden har blitt brukt til å visualisere lokaliseringen og dynamikken til LD i cellekulturer, har noen rapporter også vist pålitelig bruk av dette fargestoffet som et LD-bildebehandlingsverktøy i vev, inkludert den humane vastus lateralis-muskelen⁴³, rotte soleus-muskelen 42 og musetarmen⁴⁴.

Her foreslår vi en optimalisert BODIPY 493/503-basert protokoll som en alternativ analytisk tilnærming for evaluering av LD-antall, areal og diameter i leverprøver fra en dyremodell av leverstatose. Denne prosedyren dekker leverprøvepreparering, vevssnitt, fargeforhold, bildeopptak og dataanalyse.

Protocol

Alle dyreprosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) og overholdt Animal Care nasjonale og europeiske direktiver og med ARRIVE-retningslinjene. 1. Eksperimentell design Par-hus 13 uker gamle mannlige Wistar-rotter i ventilerte bur under kontrollerte miljøforhold med temperatur (22 ° C ± 1 ° C), fuktighet (50% -60%) og lys (12 t lys-mørk syklus) og med ad…

Representative Results

Den vellykkede utførelsen av denne teknikken skal resultere i klar lipiddråpefarging for samtidig karakterisering av LD-morfologien (form og lipidkjernetetthet basert på 3D-rekonstruksjonen) sammen med deres romlige fordeling, antall per totalt areal og gjennomsnittlig størrelse (vurdert med rørledningen ovenfor beskrevet, figur 1). …

Discussion

Denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserte protokollen for LD-vurdering hadde som mål å utvikle en ny bildebehandlingsmetode for evaluering av hepatisk steatose. Gitt den sterke korrelasjonen mellom fedme og fettleversykdom, ble den vestlige stilen med høyt fett diett brukt til å etablere en dyremodell av hepatisk steatose²⁶. En robust økning i hepatisk TG-innhold ble bekreftet av et kvantitativt triglyseridkolorimetrisk analysesett, som antydet et økt hepatisk lipidosescenario hos HFD-matede d…

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss