Verwendung des MouseWalkers zur Quantifizierung der Dysfunktion des Bewegungsapparates in einem Mausmodell für Rückenmarksverletzungen
Summary
Es wird eine experimentelle Pipeline zur quantitativen Beschreibung des Bewegungsmusters von frei gehenden Mäusen mit der MouseWalker (MW) Toolbox bereitgestellt, die von ersten Videoaufnahmen und Tracking bis hin zur Analyse nach der Quantifizierung reicht. Ein Modell für Rückenmarksprellungen bei Mäusen wird verwendet, um die Nützlichkeit des MW-Systems zu demonstrieren.
Abstract
Die Ausführung komplexer und hochkoordinierter motorischer Programme, wie Gehen und Laufen, ist abhängig von der rhythmischen Aktivierung von spinalen und supraspinalen Schaltkreisen. Nach einer thorakalen Rückenmarksverletzung ist die Kommunikation mit den vorgelagerten Kreisläufen gestört. Dies wiederum führt zu einem Koordinationsverlust mit begrenztem Erholungspotenzial. Um den Grad der Genesung nach der Verabreichung von Medikamenten oder Therapien besser beurteilen zu können, sind daher neue, detailliertere und genauere Instrumente erforderlich, um den Gang, die Koordination der Gliedmaßen und andere feine Aspekte des Bewegungsverhaltens in Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen zu quantifizieren. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Assays entwickelt, um das Freilaufverhalten von Nagetieren quantitativ zu bewerten. Ihnen fehlen jedoch in der Regel direkte Messungen in Bezug auf Schrittschrittstrategien, Fußabdruckmuster und Koordination. Um diese Unzulänglichkeiten zu beheben, wird eine aktualisierte Version des MouseWalkers bereitgestellt, die einen frustrierten Totalreflexions-Laufsteg (fTIR) mit Tracking- und Quantifizierungssoftware kombiniert. Dieses Open-Source-System wurde angepasst, um mehrere grafische Ausgaben und kinematische Parameter zu extrahieren, und eine Reihe von Nachquantifizierungswerkzeugen kann zur Analyse der bereitgestellten Ausgabedaten verwendet werden. Dieses Manuskript zeigt auch, wie diese Methode, verbunden mit bereits etablierten Verhaltenstests, Bewegungsdefizite nach Rückenmarksverletzungen quantitativ beschreibt.
Introduction
Die effektive Koordination von vier Gliedmaßen ist nicht nur bei vierbeinigen Tieren der Fall. Die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen beim Menschen ist nach wie vor wichtig, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen, wie z. B. Schwimmen und Geschwindigkeitsänderungen beim Gehen1. Verschiedene gliedmaßenkinematische2 und motorische Programme 1,3,4 sowie propriozeptive Rückkopplungskreise5 sind zwischen Menschen und anderen Säugetieren konserviert und sollten bei der Analyse von therapeutischen Optionen für motorische Störungen, wie z. B. Rückenmarksverletzungen (SCI)6,7,8, berücksichtigt werden.
Um gehen zu können, müssen mehrere Wirbelsäulenverbindungen von den Vorder- und Hintergliedmaßen richtig verdrahtet und rhythmisch aktiviert werden, was Inputs des Gehirns und Feedback des somatosensorischen Systems erfordert 2,9,10. Diese Verbindungen gipfeln in den zentralen Mustergeneratoren (CPGs), die sich auf zervikaler und lumbaler Ebene für die Vorder- bzw. Hintergliedmaßen befinden 1,9,10. Häufig schränken nach einer Rückenmarksverletzung die Störung der neuronalen Konnektivität und die Bildung einer inhibitorischen Glianarbe12 die Wiederherstellung der Bewegungsfunktion ein, wobei die Ergebnisse je nach Verletzungsschwere von einer vollständigen Lähmung bis hin zu einer eingeschränkten Funktion einer Gruppe von Gliedmaßen variieren. Instrumente zur präzisen Quantifizierung der Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung sind entscheidend für die Überwachung der Genesung und die Bewertung der Auswirkungen von Behandlungen oder anderen klinischen Interventionen6.
Der standardmäßige metrische Assay für Maus-Prellungsmodelle der Rückenmarksverletzung ist die Basso-Maus-Skala (BMS)13,14, ein nicht-parametrischer Score, der die Rumpfstabilität, die Schwanzposition, das Plantartreten und die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen in einem offenen Feld berücksichtigt. Obwohl das BMS in den meisten Fällen äußerst zuverlässig ist, sind mindestens zwei erfahrene Bewerter erforderlich, um alle Winkel der Tierbewegung zu beobachten, um die natürliche Variabilität zu berücksichtigen und Verzerrungen zu reduzieren.
Es wurden auch andere Assays entwickelt, um die motorische Leistung nach einer Rückenmarksverletzung quantitativ zu bewerten. Dazu gehört der Rotarod-Test, bei dem die Zeit gemessen wird, die an einem rotierenden Zylinder15 verbracht wird; die horizontale Leiter, die die Anzahl der fehlenden Geländer und der positiven Leitergreifer misst16,17; und der Beam-Walking-Test, der die Zeit misst, die ein Tier benötigt, und die Anzahl der Fehler, die es beim Überqueren eines schmalen Balkens18 macht. Obwohl es sich um eine Kombination von motorischen Defiziten handelt, liefert keiner dieser Tests direkte lokomotorische Informationen über die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen.
Um das Gehverhalten spezifisch und gründlicher zu analysieren, wurden weitere Assays entwickelt, um Schrittzyklen und Gangstrategien zu rekonstruieren. Ein Beispiel ist der Fußabdrucktest, bei dem die eingefärbten Pfoten eines Tieres ein Muster über ein weißes Blatt Papier zeichnen19. Obwohl es einfach in der Ausführung ist, ist das Extrahieren von kinematischen Parametern wie der Schrittlänge umständlich und ungenau. Darüber hinaus schränkt das Fehlen dynamischer Parameter, wie z. B. die Dauer des Schrittzyklus oder die zeitgesteuerte Koordination der Beine, seine Anwendungen ein. In der Tat können diese dynamischen Parameter nur durch die Analyse von Bild-für-Bild-Videos von Nagetieren erfasst werden, die durch eine transparente Oberfläche laufen. Für SCI-Studien haben die Forscher das Gehverhalten aus seitlicher Sicht mit einem Laufband analysiert, einschließlich der Rekonstruktion des Schrittzyklus und der Messung der Winkelvariationen jedes Beingelenks 4,20,21. Auch wenn dieser Ansatz äußerst informativ sein kann6, konzentriert er sich auf eine bestimmte Gruppe von Gliedmaßen und es fehlen zusätzliche Gangmerkmale, wie z. B. Koordination.
Um diese Lücken zu schließen, entwickelten Hamers und Kollegen einen quantitativen Test, der auf einem optischen Berührungssensor basiert, der frustrierte interne Totalreflexion (fTIR) verwendet22. Bei dieser Methode breitet sich das Licht durch interne Reflexion durch Glas aus, wird beim Pfotendrücken gestreut und schließlich von einer Hochgeschwindigkeitskamera erfasst. In jüngerer Zeit wurde eine Open-Source-Version dieser Methode namens MouseWalker zur Verfügung gestellt, und dieser Ansatz kombiniert einen fTIR-Laufsteg mit einem Tracking- und Quantifizierungssoftwarepaket23. Mit dieser Methode kann der Benutzer eine große Anzahl quantitativer Parameter extrahieren, darunter Schritt-, Raum- und Gangmuster, Fußabdruckpositionierung und Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen sowie visuelle Ausgaben, wie z. B. Fußabdruckmuster (in Anlehnung an den eingefärbten Pfoten-Assay6) oder Standphasen relativ zur Körperachse. Wichtig ist, dass aufgrund des Open-Source-Charakters neue Parameter durch Aktualisieren des MATLAB-Skriptpakets extrahiert werden können.
Hier wird die zuvor veröffentlichte Zusammenstellung des MouseWalker23 Systems aktualisiert. Es wird eine Beschreibung der Einrichtung mit allen Schritten bereitgestellt, die erforderlich sind, um die beste Videoqualität, die Tracking-Bedingungen und die Parametererfassung zu erreichen. Zusätzliche Werkzeuge nach der Quantifizierung werden ebenfalls zur Verfügung gestellt, um die Analyse des MouseWalker (MW)-Ausgabedatensatzes zu verbessern. Schließlich wird die Nützlichkeit dieses Instruments demonstriert, indem quantifizierbare Werte für die allgemeine Bewegungsleistung, insbesondere für Schrittzyklen und die Koordination von Vordergliedmaßen und Hintergliedmaßen, im Zusammenhang mit einer Rückenmarksverletzung (SCI) ermittelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird das Potenzial der MouseWalker-Methode durch die Analyse des Bewegungsverhaltens nach Rückenmarksverletzung demonstriert. Es bietet neue Einblicke in spezifische Veränderungen der Schritt-, Fußabdruck- und Gangmuster, die sonst von anderen Standardtests übersehen würden. Neben der Bereitstellung einer aktualisierten Version des MW-Pakets werden die Datenanalysewerkzeuge auch mit den mitgelieferten Python-Skripten beschrieben (siehe Schritt 5).
Da der MW einen großen Datensatz un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Laura Tucker und Natasa Loncarevic für ihre Kommentare zum Manuskript und die Unterstützung durch die Nagetiereinrichtung des Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung von Prémios Santa Casa Neurociências – Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) an L.S. und C.S.M. Diese Arbeit wurde von der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 und UIDP/04462/2020) und LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) an C.S.M. L.S. durch einen CEEC Individual Principal Investigator-Vertrag (2021.02253.CEECIND) unterstützt. A.F.I. wurde durch ein Promotionsstipendium des FCT (2020.08168.BD) unterstützt. A.M.M. wurde durch ein Promotionsstipendium des FCT (PD/BD/128445/2017) unterstützt. I.M. wurde durch ein Postdoktoranden-Stipendium des FCT unterstützt (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. wurde durch ein Promotionsstipendium des FCT (SFRH/BD/138636/2018) unterstützt.
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
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