En experimentell pipeline för att kvantitativt beskriva det rörelsetiska mönstret hos fritt gående möss med hjälp av verktygslådan MouseWalker (MW) tillhandahålls, allt från initiala videoinspelningar och spårning till postkvantifieringsanalys. En ryggmärgskontusionsskademodell hos möss används för att demonstrera användbarheten av MW-systemet.
Genomförandet av komplexa och högt samordnade motorprogram, såsom promenader och löpning, är beroende av rytmisk aktivering av ryggrads- och supraspinalkretsar. Efter en ryggmärgsskada i bröstkorgen försämras kommunikationen med uppströmskretsar. Detta leder i sin tur till en förlust av samordning, med begränsad återhämtningspotential. För att bättre utvärdera graden av återhämtning efter administrering av läkemedel eller terapier finns det därför en nödvändighet av nya, mer detaljerade och exakta verktyg för att kvantifiera gång, lemkoordination och andra fina aspekter av rörelsebeteende i djurmodeller av ryggmärgsskada. Flera analyser har utvecklats under åren för att kvantitativt bedöma fritt gångbeteende hos gnagare; De saknar dock vanligtvis direkta mätningar relaterade till steggångstrategier, fotavtrycksmönster och samordning. För att åtgärda dessa brister tillhandahålls en uppdaterad version av MouseWalker, som kombinerar en frustrerad total intern reflektion (fTIR) gångväg med spårnings- och kvantifieringsprogramvara. Detta system med öppen källkod har anpassats för att extrahera flera grafiska utgångar och kinematiska parametrar, och en uppsättning efterkvantifieringsverktyg kan vara att analysera de utdata som tillhandahålls. Detta manuskript visar också hur denna metod, allierad med redan etablerade beteendetester, kvantitativt beskriver rörelsestörningar efter ryggmärgsskada.
Den effektiva samordningen av fyra lemmar är inte unik för fyrbenta djur. Koordination mellan framben och bakben hos människor är fortfarande viktigt för att utföra flera uppgifter, såsom simning och hastighetsförändringar när man går1. Olika extremitetskinematiska2 och motoriska program 1,3,4, liksom proprioceptiva återkopplingskretsar5, bevaras mellan människor och andra däggdjur och bör beaktas vid analys av terapeutiska alternativ för motoriska störningar, såsom ryggmärgsskada (SCI) 6,7,8.
För att kunna gå måste flera ryggradsanslutningar från frambenen och bakbenen vara ordentligt kopplade och rytmiskt aktiverade, vilket kräver inmatningar från hjärnan och återkoppling från det somatosensoriska systemet 2,9,10. Dessa anslutningar kulminerar i de centrala mönstergeneratorerna (CPG), som är belägna på livmoderhals- och ländryggsnivå för frambenen respektivebakbenen 1,9,10. Ofta, efter SCI, begränsar störningen av neuronal anslutning och bildandet av ett hämmande glialärr12 återhämtningen av rörelsefunktionen, med resultat som varierar från total förlamning till begränsad funktion av en grupp lemmar beroende på skadans svårighetsgrad. Verktyg för att exakt kvantifiera rörelsefunktionen efter SCI är avgörande för att övervaka återhämtning och utvärdera effekterna av behandlingar eller andra kliniska ingrepp6.
Den metriska standardanalysen för muskontusionsmodeller av SCI är Basso-musskalan (BMS)13,14, en icke-parametrisk poäng som tar hänsyn till bålstabilitet, svansposition, plantarsteg och koordination mellan framben och bakben i en öppen fältarena. Även om BMS är extremt tillförlitligt i de flesta fall krävs det minst två erfarna bedömare för att observera alla vinklar av djurrörelser för att ta hänsyn till naturlig variation och minska bias.
Andra analyser har också utvecklats för att kvantitativt bedöma motorisk prestanda efter SCI. Dessa inkluderar rotarodtestet, som mäter tiden som spenderas på en roterande cylinder15; Den horisontella stegen, som mäter antalet missade räcken och positiva steggrepp16,17; och strålgångstestet, som mäter den tid ett djur tar och antalet fel det gör när man korsar en smal stråle18. Trots att de återspeglar en kombination av motoriska underskott ger inget av dessa tester direkt lokomotorisk information om koordinationen mellan framben och bakben.
För att specifikt och mer grundligt analysera gångbeteende har andra analyser utvecklats för att rekonstruera stegcykler och gångstrategier. Ett exempel är fotavtryckstestet, där ett djurs färgade tassar ritar ett mönster över ett vitt papper19. Även om det är enkelt att utföra är det besvärligt och felaktigt att extrahera kinematiska parametrar som steglängd. Dessutom begränsar avsaknaden av dynamiska parametrar, såsom varaktigheten av stegcykeln eller bentidskoordinationen, dess tillämpningar. Faktum är att dessa dynamiska parametrar endast kan förvärvas genom att analysera ram-för-ram-videor av gnagare som går genom en transparent yta. För SCI-studier har forskare analyserat gångbeteende från en sidovy med hjälp av ett löpband, inklusive rekonstruktion av stegcykeln och mätning av vinkelvariationerna i varje benled 4,20,21. Även om detta tillvägagångssätt kan vara extremt informativt6, förblir det fokuserat på en specifik uppsättning lemmar och saknar ytterligare gångfunktioner, såsom samordning.
För att fylla dessa luckor utvecklade Hamers och kollegor ett kvantitativt test baserat på en optisk beröringssensor med hjälp av frustrerad total intern reflektion (fTIR)22. I denna metod sprids ljus genom glas via intern reflektion, sprids vid tasspressning och fångas slutligen av en höghastighetskamera. På senare tid har en öppen källkodsversion av denna metod, kallad MouseWalker, gjorts tillgänglig, och detta tillvägagångssätt kombinerar en fTIR-gångväg med ett programvarupaket för spårning och kvantifiering23. Med hjälp av denna metod kan användaren extrahera en stor uppsättning kvantitativa parametrar, inklusive steg-, rums- och gångmönster, fotavtryckspositionering och koordination mellan framben och bakben, samt visuella utdata, såsom fotavtrycksmönster (efterliknar den färgade tassanalysen6) eller hållningsfaser i förhållande till kroppsaxeln. Viktigt, på grund av dess öppen källkod, kan nya parametrar extraheras genom att uppdatera MATLAB-skriptpaketet.
Här uppdateras den tidigare publicerade sammansättningen av MouseWalker23-systemet . En beskrivning av hur du ställer in den tillhandahålls, med alla steg som krävs för att uppnå bästa videokvalitet, spårningsförhållanden och parameterförvärv. Ytterligare postkvantifieringsverktyg delas också för att förbättra analysen av MouseWalker (MW) utdatadataset. Slutligen demonstreras användbarheten av detta verktyg genom att erhålla kvantifierbara värden för allmän rörelseförmåga, särskilt stegcykler och samordning mellan framben och bakben, i ett ryggmärgsskada.
Här demonstreras potentialen hos MouseWalker-metoden genom att analysera lokomotoriskt beteende efter SCI. Det ger nya insikter i specifika förändringar i steg-, fotavtrycks- och gångmönster som annars skulle missas av andra standardtester. Förutom att tillhandahålla en uppdaterad version av MW-paketet beskrivs även dataanalysverktyg med hjälp av de medföljande Python-skripten (se steg 5).
Eftersom MW genererar ett stort dataset och en samling kinematiska parametrar som återspeglar …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Laura Tucker och Natasa Loncarevic för deras kommentarer till manuskriptet och stödet från gnagareanläggningen vid Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Författarna vill uppmärksamma ekonomiskt stöd från Prémios Santa Casa Neurociências – Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) till L.S. och C.S.M. Detta arbete stöddes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 och UIDP/04462/2020) och LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) till C.S.M. L.S. stöddes av ett kontrakt med den central- och östeuropeiska enskilda forskningsledaren (2021.02253.CEECIND). AFI stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (2020.08168.BD). A.M.M. stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. stöddes av ett postdoktoralt stipendium från FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (SFRH/BD/138636/2018).
45º Mirror | |||
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
Background backlight | |||
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
fTIR Support base and posts | |||
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
fTIR Walkway | |||
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
High speed camera (on a tripod) | |||
Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
Infinite Horizon Impactor | |||
Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
Lens | |||
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
Software | |||
MATLAB R2022b | MathWorks | ||
Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
Walkway wall | |||
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
GitHub Materials | |||
Folder name | URL | ||
Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |