Här presenterar vi en anpassning av kromosomkonformationstekniken (3C) i detalj med tonvikt på grundutbildning och lärande.
Kromosomkonformationsfångst (3C) är ett kraftfullt verktyg som har gett upphov till en familj av liknande tekniker (t.ex. Hi-C, 4C och 5C, här kallade 3C-tekniker) som ger detaljerad information om den tredimensionella organisationen av kromatin. 3C-teknikerna har använts i ett brett spektrum av studier, från att övervaka förändringarna i kromatinorganisationen i cancerceller till att identifiera förstärkare som gjorts med genpromotorer. Medan många av studierna som använder dessa tekniker ställer stora genomomfattande frågor med invecklade provtyper (dvs. encellsanalys), är det ofta förlorat att 3C-teknikerna är grundade i grundläggande molekylärbiologiska metoder som är tillämpliga på ett brett spektrum av studier. Genom att ta itu med tätt fokuserade frågor om kromatinorganisation kan denna banbrytande teknik användas för att förbättra grundforskningen och undervisningslaboratorieupplevelsen. Detta dokument presenterar ett 3C-protokoll och ger anpassningar och tyngdpunkter för implementering vid främst grundutbildningsinstitutioner i grundforskning och undervisningserfarenheter.
En organisms genom innehåller inte bara alla gener som krävs för funktion utan också alla instruktioner om hur och när de ska användas. Detta gör reglering av tillgången till genomet till en av cellens viktigaste funktioner. Det finns många mekanismer för att kontrollera genfunktionen; Men på basnivå kommer genreglering ner till förmågan hos regulatoriska transkriptionsfaktorer (transfaktorer) att binda till sina specifika DNA-sekvenser (cis-regulatoriska sekvenser). Detta är inte en medfödd förmåga; Istället styrs den av organisationen/strukturen av genomet i kärnan, som styr tillgängligheten/exponeringen av de cis-regulatoriska sekvenserna för transfaktorerna 1,2,3. Om transfaktorerna inte kan hitta sina cis-regulatoriska sekvenser, kan transfaktorerna inte utföra sina reglerande uppgifter. Detta har gjort förståelse för hur genomer är organiserade i kärnan en viktig källa till undersökning.
Det är allmänt accepterat att eukaryota kromosomer i kärnan under interfas upptar sin egen domän förankrad i kärnlamina och kärnmatris (figur 1), vilket gör kromosomen mer som en skiva pizza, snarare än en nudel på en tallrik spagetti. Kromosomer kondenseras delvis av protein-DNA-interaktioner (kromatin) som vrider och slingar delar av kromosomen. Genom elektronmikroskopi, tredimensionell DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) och DNA-märkningstekniker (dvs. fluorescerande och artificiell DNA-metylering) har inaktiva domäner av kromatin visat sig vara tätt packade längs kärnperiferin 4,5,6, medan delar av aktivt, mindre kondenserat kromatin finns i kärnans inre 7,8,9, 10. Dessa experiment ger en vidvinkelbild av kromosomdynamiken men gör lite för att fånga de förändringar som sker lokalt runt genpromotorerna som observerats i DNas11,12 och nukleosom13,14,15 studier.
Nyckeln till att låsa upp kromatindynamik med högre upplösning var formuleringen av 3D-kromosomkartläggningstekniken, 3C. 3C-tekniken i sig består av fyra huvudsteg: tvärbindning av kromatin, kromatinuppslutning genom restriktionsenzymer, kromatinligering och DNA-rening (figur 2). De nya artificiella DNA-fragmenten som genereras av denna process kan sedan karakteriseras för att avslöja den nära fysiska kopplingen mellan linjärt avlägsna bitar av DNA16. 3C-tekniken blev grunden för skapandet av flera spin-off-tekniker som utnyttjar de första stegen i 3C för att ställa bredare genomomfattande frågor (t.ex. Hi-C, 4C, ChIP-C). Denna familj av 3C-tekniker har identifierat att kromosomer är organiserade i flera diskreta enheter som kallas topologiskt associerade domäner (TADs). TADs kodas i genomet och definieras av kromatinslingor flankerade av oloopade gränser16,17,18,19. TAD-gränserna upprätthålls av två evolutionärt bevarade och allestädes närvarande faktorer, inklusive CCCT-bindningsfaktor (CTCF) och kohesion, som förhindrar att slingor inom separata TAD interagerar16,20. Slingorna medieras av transfaktorernas interaktion med deras regulatoriska sekvenser, liksom CTCF och kohesion21.
Även om många studier som använder 3C-teknik ställer breda genomomfattande frågor och använder komplicerade provinsamlingstekniker, är formuleringen av 3C-tekniken baserad på grundläggande molekylärbiologiska tekniker. Detta gör 3C spännande för distribution i både grundforskning och undervisningslaboratorier. 3C-tekniken kan användas för mindre fokuserade frågor och är i sig flexibel för uppskalning eller nedskalning (enstaka gener22, kromosomer16 och / eller genom18) beroende på fokus och riktning för de frågor som ställs. Denna teknik har också tillämpats på ett brett spektrum av modellsystem 7,16,19,23 och har visat sig vara mångsidig i sin användning. Detta gör 3C till en utmärkt teknik för studenter genom att eleverna kan få erfarenhet av vanliga molekylärbiologiska tekniker samtidigt som de får värdefull erfarenhet av att svara på riktade frågor.
Här presenteras ett anpassat protokoll för 3C-biblioteksberedning baserat på tidigare publicerade protokoll24,25,26,27. Detta protokoll har optimerats för ungefär 1 × 107 celler, även om det har genererat 3C-bibliotek med så lite som 1 × 105 celler. Detta protokoll har visat sig vara mångsidigt och har använts för att generera 3C-bibliotek från zebrafiskembryon, zebrafiskcellinjer och unga vuxna (YA) Caenorhabditis elegans (rundmask). Protokollet bör också vara lämpligt för cellinjer från däggdjur och, med ytterligare anpassning, jäst.
Målet med dessa anpassningar är att göra 3C mer tillgängligt för studenter. Försiktighet har vidtagits för att använda tekniker som liknar dem som kan åstadkommas i ett grundutbildningslaboratorium. 3C-tekniken ger många inlärningsmöjligheter för studenter att lära sig grundläggande molekylärbiologiska tekniker som kommer att gynna deras utveckling vid bänken, i klassrummet och i deras ansträngningar efter examen.
3C är en kraftfull teknik som är förankrad i grundläggande molekylära tekniker. Det är denna grund för grundläggande verktyg som gör 3C till en så spännande teknik att använda med studenter. Med så många nya studier som observerar kromatindynamik i så stor skala, har användningen av dessa resultat för att utforma ett smalfokuserat experiment på en enda gen eller genomisk region potential att skapa ett unikt och effektfullt experiment i grundforskning. Ofta anses experiment som dessa vara för avancerade för studenter, men med noggrann planering är de lätt att uppnå. Det är viktigt att notera att analyserna som är utformade för att undersöka kromatinanslutningarna som fångas av 3C-biblioteket kan variera från semikvantitativ slutpunkt PCR till helgenomsekvensering. Faktum är att data från det första 3C-papperet16 genererades från qPCR. Detta breda spektrum av analyser kan alla användas eftersom alla 3C-tekniker producerar samma produkt – ett bibliotek av DNA-fragment som representerar 3D-anslutningar i kärnan.
Här presenteras en anpassning av ett mer flexibelt och tillmötesgående protokoll som passar bättre för grundforskare. De pausperioder som anges ovan innebär förseningar över natten. Dessa pauser kan dock sträcka sig över helger och, när det gäller celler och kärnor, i veckor. Det viktigaste övervägandet är när arbetet kommer att bli gjort. Ofta i protokoll finns det tidskänsliga steg när paus inte är ett alternativ. Utanför några punkter (dag 1 och dag 2) finns det många ställen att stanna och frysa provet. Dessa är kritiska när man arbetar med studenter där scheman och tidpunkter för laboratoriearbete måste vara flexibla. Förutom att konstruera dessa stopp i protokollet uppmuntras studenter att arbeta i par eller till och med små grupper om tre eller fyra. Grupper fungerar bra för detta protokoll, eftersom eleverna kan stödja varandra och skapa ett kompissystem så att alla arbetar säkert. Laborationer är också roligare med andra inblandade. Med grupper kan eleverna också arbeta med en mängd olika frågor med fokus på organisationen av kromatin medan de fortfarande utför samma protokoll. Således, även när eleverna arbetar med separata projekt, länkar protokollet sina ansträngningar, och på grund av detta kan de stödja varandra.
Andra anpassningar är avsedda att fungera runt det faktum att vissa specialverktyg och utrustning inte nödvändigtvis finns i alla grundutbildningsinstitutioner. Dessa utrustningar inkluderar men är inte begränsade till qPCR-termocykler, geldokumentationssystem och nanovolymspektrometrar. Faktum är att dessa utrustningar är praktiska men är inte ett krav. Här beskrivs den klassiska metoden för 3C också i primerdesigndelen; Detta innebär att identifiera en genomisk plats av intresse och utifrån det bedöma andra genomiska loci för kromatinkontaktpunkter längre bort. Den här tekniken fungerar också bra om en publicerad datauppsättning används, till exempel en datauppsättning som använder Hi-C, där kända positiva (anslutande) och negativa (icke-anslutande) lokus identifieras. Att utforma experiment med hjälp av dessa publicerade dataset är en annan stor anpassning för undervisningslaboratorier, eftersom chansen för framgångsrik identifiering av kromatinanslutningar vanligtvis är större. Dessutom kan forskningsartikeln diskuteras i klassen och användas som referens.
Detta protokoll använder en modifierad qPCR-metod för att visualisera 3C-produktbildningen. Kontroller är avgörande för framgången med 3C-tekniken. Varje experiment använder både provkontroller och primerkontroller för att bestämma slutförandet av 3C-proceduren. Provkontrollerna inkluderar en osmält kontroll (genomiskt DNA) och smält kontroll. Den osmälta kontrollen bestämmer baslinjesignalen för primeruppsättningarna och används med den tvärbundna matsmältningskontrollen för att bestämma matsmältningseffektiviteten Det förväntas att det kommer att finnas en minskning av produkten för alla primers riktade över ett restriktionsställe. Att jämföra detta värde med den osmälta kontrollen ger en indikation på hur väl provet smältes.
Primers för PCR inkluderar en kontrollprimer och testprimers. Kontrollprimern är en primeruppsättning som ligger nära den genomiska regionen som analyseras och inte innehåller ett restriktionsställe. Detta ger baslinjen för att bestämma överflödet av testprimerns PCR-produkter. Testprimers är framåt- och bakåtprimers som flankerar ett restriktionsställe för en viss genomisk plats av intresse (figur 3). Reaktioner som använder dessa primeruppsättningar jämförs för att bestämma matsmältningseffektiviteten, eftersom produktens överflöd bör sjunka om begränsningsstället har skurits. Vid bestämning av kromatinorganisationen paras en testprimer från en locus ihop med en annan testprimer från en annan genomisk locus för att bestämma om dessa två loci är nära varandra i 3D-rymden. I så fall är förväntningen att en PCR-produkt endast skulle hittas med 3C-provet som mall.
Det är viktigt att notera att även validerade primers har en tendens att misslyckas (Figur 4: r14 primeruppsättning). Dessutom identifieras PCR-produkter ofta i kontrollreaktioner och i reaktioner där en kromatinanslutning inte förutsägs (såsom den smälta kontrollen, eftersom den inte ligeras). Dessa instanser sekvenseras och misslyckas antingen med Sanger QC eller returneras utan en definierad sekvens (figur 5). Dessutom genererar traditionella 3C-experiment en “kontrollmall”, ett otvärbundet, smält och ligerat DNA-prov, som representerar alla möjliga ligerade fragment som kan produceras med en given mängd DNA. “Kontrollmallen” spelar en viktig roll för att jämföra intensiteten hos qPCR-signaler mellan två genomiska loci för att avgöra om signalen representerar en sann interaktion eller bara en slumpmässig association. Att skapa en “kontrollmall” kan vara problematisk, eftersom en stor del av kromatinet som analyseras måste fångas i form av en artificiell kromosom och bearbetas tillsammans med 3C-proverna. Att säkra en sådan konstruktion kanske inte är genomförbar, och att skapa en kan ligga utanför ramen för ett terminsprojekt. På grund av dessa svårigheter föreslår vi att du använder en kontrollprimer. Kontrollprimern ersätter inte alla funktioner i “kontrollmallen” men ger fortfarande möjlighet att analysera data för att göra “närvaro” eller “frånvaro” -bestämningar.
Vid utförande av qPCR är det viktigt att använda lika stora mängder av provet. Detta bör bestämmas, även om man använder en nanospektrofotometer såsom en nanodroppe, genom att generera en standardkurva från genomiskt DNA med en känd koncentration och anpassa 3C-proverna till den linjen. Dessa mängder bör registreras och användas i efterföljande PCR-rapporter. Kvaliteten på PCR-reaktionen är också viktig. Eftersom PCR körs i qPCR mäts produktens överflöd med fluorescens och registreras. Denna inspelning är tillgänglig i förstärkningsdiagrammet. När programmet är klart är det viktigt att kontrollera förstärkningsdiagrammet och se till att reaktionerna (förutom kontrollerna utan mall) har tre faser: en baslinje, en exponentiell och en platå/mättnadsfas. Det är viktigt att kontrollera att reaktionerna har en exponentiell fas, särskilt för att fastställa tröskelvärdet (se nedan). För serieutspädda prover bör dessutom Ct-värdena ändras i överensstämmelse med utspädningen av provet (den högsta koncentrationen har de lägsta Ct-värdena, medan den lägsta koncentrationen har de högsta Ct-värdena). Prover som inte återspeglar denna förändring i amplifieringskurvan kräver en ny utspädning eller indikerar ett större problem med 3C-provbildningen. Slutligen, medan standardkurvan genereras, beräknar PCR-programvaran PCR-effektiviteten och R2-värdet . PCR-effektiviteten bör vara större än 90 % ochR2-värdet bör vara större än 0,99. Om något av dessa villkor inte är uppfyllt är det troligt att något är fel med provet eller PCR-primrarna.
Efter qPCR kan den procentuella matsmältningen och närvaron av 3C-interaktioner beräknas med qPCR Ct för varje reaktion. För att bestämma dessa måste först tröskeln för PCR-reaktionen fastställas. Detta görs normalt med hjälp av programvaran som medföljer qPCR-maskinen. Om tröskelvärdet fastställs definieras koncentrationen av PCR-produkten som ska användas för att jämföra Ct-provvärdena. Tröskelvärdet bör dela förstärkningskurvorna för PCR-reaktionerna i den exponentiella förstärkningsfasen. Endast PCR-reaktioner med exponentiell amplifiering kan jämföras (i detta fall kontrollprimrarna och testprimerreaktionerna), eftersom detta är det enda sättet att säkerställa att reaktionerna förstärker DNA i samma takt och kan jämföras troget. Vid analys av 3C-graferna identifieras villkorligt positiva reaktioner som de med mer produkt över kontrollproverna, genomisk kontroll och matsmältningskontroll (figur 4B). Dessa prover måste dock valideras ytterligare med hjälp av Sanger-sekvensering efter gelrening av PCR-produkten.
Efter Sanger-sekvensering kan prover som passerar QC analyseras med Blat. Målet med denna analys är att avgöra om provet har sekvensen av båda målgenomiska loci som flankerar restriktionsstället (DpnII i fallet med detta protokoll). Om båda sekvenserna identifieras kan 3C-fragmentet betraktas som validerat. Om resultaten av Blat inte returnerar den förväntade sekvensen kan detta indikera att en eller båda primrarna inte är optimala, vilket resulterar i ett falskt positivt qPCR-resultat. Spårningsfilerna för de falska positiva proverna kommer att ha odefinierade bastoppar och Seq-rapporterna innehåller mestadels “n” basanrop.
Sanger-validering är avgörande, eftersom falska positiva resultat från artefaktisk PCR-produktbildning är möjliga. Dessa falska positiva resultat kan identifieras när sekvenseringsprodukterna inte har den förväntade målsekvensen eller en DpnII-plats som är karakteristisk för ett korrekt 3C-fragment (figur 5). Sekvenseringen av PCR-fragmenten ger också en annan datapunkt för experimentet och driver hem till eleverna att 3C-tekniken identifierar avlägsna genomiska loci som samlas i 3D-rymden i kärnorna.
3C-tekniken ger en mängd grundläggande molekylära tekniker för studenter i ett flexibelt, enkelt förfarande. Denna 3C-teknik är också en startpunkt för de andra 3C-teknikerna som innehåller nästa generations sekvensering (NGS). Dessa typer av experiment kan utsätta studenter för viktiga aspekter av bioinformatik och är förankrade i de grundläggande principerna som beskrivs här. Grundutbildning och engagemang är nyckeln till deras framgång och utveckling som unga forskare. Genom att ge dessa möjligheter kan studenter stärka sin förståelse för grundläggande principer samtidigt som de bygger sitt förtroende för att ta itu med avancerade tekniker och frågor.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20GM103430 och Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.
37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
DpnII | NEB | R0543M | |
Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |