תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית
Summary
מתנול יכול לשמש כמדיום עזר קבוע עבור תכשירים ברשתית שלמות הר אחסון לטווח ארוך, אשר שימושי לחקירה של תאי גנגליון ברשתית.
Abstract
תאי גנגליון ברשתית (RGCs), שהם נוירוני ההקרנה של הרשתית, מפיצים מידע חזותי חיצוני למוח. לשינויים פתולוגיים ב- RGCs יש קשר הדוק עם מחלות ניווניות רבות ברשתית. Whole-mount retinal immunostaining משמש לעתים קרובות במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים ההתפתחותיים והפתולוגיים של הרשתית. בנסיבות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לשמור כמה דגימות רשתית יקרות ערך, כגון אלה מעכברים טרנסגניים, לתקופה ארוכה מבלי להשפיע על המורפולוגיה או על מספר RGCs. לקבלת תוצאות ניסוי אמינות וניתנות לשחזור, שימוש במדיום שימור יעיל הוא חיוני. כאן, אנו מתארים את ההשפעה של מתנול כאמצעי עזר קבוע עבור תכשירים רשתית מלאה ואחסון לטווח ארוך. בקצרה, במהלך תהליך הבידוד, מתנול קר (-20 ° C) הוא pipeted על פני השטח של הרשתית כדי לעזור לתקן את הרקמות ולהקל על החדירות שלהם, ולאחר מכן הרשתית ניתן לאחסן מתנול קר (-20 ° C) לפני להיות immunostained. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה של בידוד הרשתית ואת פרוטוקול אחסון דגימות הרקמות, שהוא שימושי ומעשי לחקירת RGCs.
Introduction
תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הם נוירוני ההקרנה היחידים ברשתית, והם משתלבים ומעבירים מידע חזותי חיצוני למוח1. מחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית מאופיינות בנזק בלתי הפיך ואובדן RGCs 2,3. ניתוח השינויים המורפולוגיים והכמותיים של RGCs הוא צעד מכריע בקביעת האופן שבו מחלות נוירודגנרטיביות מתפתחות ומתקדמות 4,5.
בדיקת אימונופלואורסנציה עקיפה היא שיטה מקובלת לניטור התפלגות החלבונים וספירת התאים. במעבדה, אימונוסטיין רשתית מלאה משמש בדרך כלל במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של הרשתית6. הסמנים הנפוצים ביותר המשמשים לכימות RGC בכל הרשתית כוללים Brn3a, חלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), וכן הלאה 7,8. אפיון הכמות והפיזור של RGCs דורש אימונוסטיין רשתית באיכות גבוהה. בדרך כלל, בפרוטוקולים של אימונוסטינינג, הרשתית שקועה בקיבועים כימיים לפני שהיא מודגרת בנוגדנים. קיבועים אידיאליים לא צריכים לשנות את צורת התאים, את הנגישות או הזיקה של האפיטופים לנוגדנים, או את הממדים הליניאריים של הרקמה 9,10.
בשל המבנה המורכב של הרשתית, בעיות כגון שבריריות רשתית וקיפול, כמו גם כמה קשיים נפוצים כולל התכווצות תאים וגרעינים לא ברורים, נוטים להתרחש בעת ביצוע תיקון רשתית שלם, אשר יש השפעה שלילית על מחקר ניסיוני. בנוסף, לא כל הרשתיות עוברות חיסון מיידי, במיוחד כשמדובר ברשתיות של עכברים טרנסגניים עם מחירים יקרים שמקורם יקר, מה שמחייב שימור דגימות הרשתית הנוספות לשימוש נוסף.
הפתרון המקבע המתאים יכול לתקן את הרקמה במהירות, להימנע מאוטוליזה של רקמות, לשמר את המורפולוגיה והמבנה הרגילים של תאי הרקמה, ולשמור על האנטיגניות של חלבונים וחומרים אחרים10. נכון לעכשיו, קיבוע מבוסס פורמלדהיד נמצא בשימוש נרחב ברקמות שונות, כולל רשתיות מופרדות, משקפיים hemisected, וגלגלי עיניים שלמים10. התכווצות רקמות ושינוי מורפולוגי של תאים הם שני האתגרים הקריטיים שנתקלים בהם בעקבות טבילה בפורמלדהיד11. בנוסף, ניסוחי קיבוע מותאמים צצים יותר ויותר כדי למקסם את השמירה על המאפיינים המקוריים של הרשתית ותאי היעד 9,10. טיפולים שונים בקיבוע רשתית עשויים להשפיע על מבנה הרשתית, אימונוגניות חלבון, עירור פלואורסצנטי , ומחזור מרווה הנחתה באופן שונה12,13. הרשתיות המקובעות בתמיסה של דוידסון שלמות יותר מבחינה מורפולוגית בהשוואה לאלה המקובעות בפורמלין, אך התמיסה של דוידסון פחות תואמת לנוגדנים מסוימים, כגון מולקולת מתאם קשירת סידן 112 של סמן מיקרוגליה. בהתחשב באופי השברירי של הרשתית, החוקרים יתהו באופן טבעי אם שלמות הרשתית, כמו גם התכונות והמורפולוגיה של תאי המטרה, ישתנו לאחר אחסון לטווח ארוך. עם זאת, ההשפעות האפשריות של תמיסת קיבוע על המורפולוגיה של תאי הרשתית וה-RGC לאחר אחסון במשך מספר חודשים דווחו רק לעתים רחוקות. אופטימיזציה של קיבוע הרשתית היא קריטית להערכה ושימור של RGCs.
אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה אמינה ופשוטה מבחינה טכנית בה אנו משתמשים לצביעת רשתית מורין בהרכבה שלמה. השיטה שלנו שמה דגש על הכנה ואחסון נכונים של רשתיות לחקירת RGC, תוך התחשבות בצורך באחסון לטווח ארוך של רקמת הרשתית וכן היבטים ספציפיים של היווצרות פלואורופור או התפרקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיבוע הוא צעד חיוני לשימור הרשתית, אשר יכול להשפיע על כל חקירות RGC הבאות המבוססות על מורפולוגיה. קיבוע מוצלח לוכד במהירות את המבנה והמצב של הרשתיות ברגע חשיפתן למדיום הקיבוע, שהוא קריטי לניתוח נוסף. למרות שפורמלדהיד נחשב לאחד מסוכני הקיבוע הנפוצים ביותר לקיבוע ושימור רקמות ותאים, פורמלדהי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי פרויקט פתיחת מעבדות מפתח חוביי (מענק מס ‘2021KFY055), הקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (מענק מס ‘2020CFB240), וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות (מענק מס ‘2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
Riferimenti
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
