Metanolbasert helmonteringspreparat for undersøkelse av retinale ganglionceller
Summary
Metanol kan brukes som et hjelpefast medium for retinale helmonteringspreparater og langtidslagring, noe som er nyttig for undersøkelse av retinale ganglionceller.
Abstract
Retinal ganglionceller (RGC), som er projeksjonsnevronene i netthinnen, forplanter ekstern visuell informasjon til hjernen. Patologiske endringer i RGC har et nært forhold til mange retinal degenerative sykdommer. Helmontert retinal immunfarging brukes ofte i eksperimentelle studier på RGC for å evaluere utviklingsmessige og patologiske forhold i netthinnen. Under noen omstendigheter kan noen verdifulle netthinneprøver, som de fra transgene mus, måtte oppbevares i lang tid uten å påvirke morfologien eller antall RGC. For troverdige og reproduserbare eksperimentelle resultater er det viktig å bruke et effektivt konserverende medium. Her beskriver vi effekten av metanol som et hjelpefast medium for netthinnepreparater og langtidslagring. Kort sagt, under isolasjonsprosessen pipetteres kald metanol (-20 ° C) på overflaten av netthinnen for å bidra til å fikse vevet og lette deres permeabilitet, og deretter kan netthinnene lagres i kald metanol (-20 ° C) før de blir immunfarget. Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for netthinneisolasjon og lagringsprotokoll for vevsprøver, noe som er nyttig og praktisk for undersøkelse av RGC.
Introduction
Retinal ganglionceller (RGC) er de eneste projeksjonsnevronene i netthinnen, og de integrerer og overfører utvendig visuell informasjon til hjernen1. Mange neurodegenerative sykdommer som glaukom og traumatisk optisk nevropati er preget av irreversibel skade og tap av RGC 2,3. Analyse av morfologiske og kvantitative endringer av RGC er et avgjørende skritt for å bestemme hvordan nevrodegenerative sykdommer utvikler og fremmer 4,5.
Indirekte immunfluorescensanalyse er en allment akseptert metode for å overvåke fordelingen av proteiner og celletelling. I laboratoriet brukes helmontert retinal immunfarging ofte i eksperimentelle studier på RGC for å evaluere de fysiologiske og patologiske forholdene i netthinnen6. De vanligste markørene som brukes til RGC-kvantifisering i hele netthinnen inkluderer Brn3a, RNA-bindende protein med multippel skjøting (RBPMS), og så videre 7,8. Karakterisering av mengden og fordelingen av RGC krever høyverdig helmontert retinal immunfarging. Generelt, i immunfargingsprotokoller, blir retina nedsenket i kjemiske fikseringsmidler før de inkuberes i antistoffer. Ideelle fikseringsmidler bør ikke endre cellens form, epitopenes tilgjengelighet eller affinitet for antistoffer, eller vevets lineære dimensjoner 9,10.
På grunn av den komplekse strukturen i netthinnen, er problemer som retinal sårbarhet og folding, samt noen vanlige vanskeligheter, inkludert cellekrymping og uklare kjerner, utsatt for å oppstå når man lager en helmontert retinal patch, som har en negativ innvirkning på eksperimentell forskning. I tillegg er ikke alle retinas immunfarget umiddelbart, spesielt når det gjelder retinas av transgene mus med dyre priser som er av dyrebar opprinnelse, noe som nødvendiggjør bevaring av de ekstra retinalprøvene for videre bruk.
Den passende fikserende løsningen kan fikse vevet raskt, unngå vevsautolyse, bevare normal morfologi og struktur av vevscellene, og holde antigeniteten til proteiner og andre stoffer10. For tiden har formaldehydbasert fiksering blitt mye brukt i forskjellige vev, inkludert separerte netthinner, hemisected eyecups og hele øyeboller10. Vevskrymping og morfologisk endring av celler er de to kritiske utfordringene som oppstår etter nedsenking i formaldehyd11. I tillegg kommer modifiserte fikseringsformuleringer i økende grad frem for å maksimere retensjonen av de opprinnelige egenskapene til netthinnen og målcellene 9,10. Ulike retinal fikseringsbehandlinger kan påvirke retinalstrukturen, proteinimmunogenisitet, fluorescenseksitasjon og dempingsslukkingssyklus forskjellig12,13. Netthinner festet med Davidsons løsning er mer morfologisk intakte sammenlignet med de som er festet med formalin, men Davidsons løsning er mindre kompatibel med noen antistoffer, for eksempel mikroglialmarkørionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 112. Med tanke på den skjøre naturen til netthinnen, vil forskerne naturlig lure på om retinal integritet, samt egenskapene og morfologien til målcellene, vil endres etter langvarig lagring. Imidlertid er mulige effekter av fikseringsløsning på retinal og RGC-cellemorfologi etter lagring i flere måneder rapportert i sjeldne tilfeller. Optimalisering av retinal fiksering er kritisk for evaluering og bevaring av RGC.
Vi gir en detaljert beskrivelse av en pålitelig og teknisk enkel metode som vi bruker for helmontering murine retinal farging. Vår metode legger vekt på riktig forberedelse og lagring av retina for RGC-undersøkelse, med tanke på behovet for langsiktig lagring av retinalvev, samt spesifikke aspekter ved fluorofordannelse eller nedbrytning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiksering er et viktig skritt for å bevare netthinnen, noe som kan påvirke eventuelle påfølgende RGC-undersøkelser basert på morfologi. Vellykket fiksering fanger raskt strukturen og tilstanden til retinaene i det øyeblikket de utsettes for fikseringsmediet, noe som er kritisk for videre analyse. Selv om formaldehyd har vært ansett som et av de vanligste fikseringsmidlene for vevs- og cellefiksering og konservering, fungerer ikke formaldehyd alene alltid godt som det optimale kjemiske fiksativet for noen undersø…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Hubei Key Laboratories Opening Project (tilskudd nr. 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei Province (grant no. 2020CFB240), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (stipend nr. 2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
Riferimenti
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
