Цельный препарат на основе метанола для исследования ганглиозных клеток сетчатки
Summary
Метанол можно использовать в качестве вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения, что полезно для исследования ганглиозных клеток сетчатки.
Abstract
Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs), которые являются проекционными нейронами сетчатки, распространяют внешнюю визуальную информацию в мозг. Патологические изменения в RGC имеют тесную связь с многочисленными дегенеративными заболеваниями сетчатки. Цельное иммуноокрашивание сетчатки часто используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки развития и патологических состояний сетчатки. При некоторых обстоятельствах некоторые ценные образцы сетчатки, например, от трансгенных мышей, может потребоваться хранить в течение длительного периода времени, не влияя на морфологию или количество RGC. Для получения достоверных и воспроизводимых экспериментальных результатов необходимо использовать эффективную консервирующую среду. Здесь мы описываем действие метанола как вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения. Короче говоря, в процессе изоляции холодный метанол (-20 ° C) пипеткой наносится на поверхность сетчатки, чтобы помочь зафиксировать ткани и облегчить их проницаемость, а затем сетчатку можно хранить в холодном метаноле (-20 ° C) перед иммуноокрашиванием. Этот протокол описывает рабочий процесс выделения сетчатки и протокол хранения образцов тканей, что полезно и практично для исследования RGC.
Introduction
Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) являются единственными проекционными нейронами в сетчатке, и они интегрируют и передают внешнюю визуальную информацию в мозг1. Многие нейродегенеративные заболевания, такие как глаукома и травматическая нейропатия зрительного нерва, характеризуются необратимым повреждением и потерей RGCs 2,3. Анализ морфологических и количественных изменений RGC является важным шагом в определении того, как развиваются и прогрессируют нейродегенеративные заболевания 4,5.
Непрямой иммунофлюоресцентный анализ является широко распространенным методом мониторинга распределения белков и подсчета клеток. В лабораторных условиях иммуноокрашивание сетчатки обычно используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки физиологических и патологических состояний сетчатки6. Наиболее распространенные маркеры, используемые для количественной оценки RGC во всей сетчатке, включают Brn3a, РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом (RBPMS) и так далее 7,8. Характеристика количества и распределения RGC требует высококачественного цельного иммуноокрашивания сетчатки. Как правило, в протоколах иммуноокрашивания сетчатка погружается в химические фиксаторы перед инкубацией в антителах. Идеальные фиксаторы не должны изменять форму клеток, доступность или сродство эпитопов к антителам или линейные размеры ткани 9,10.
Из-за сложной структуры сетчатки такие проблемы, как хрупкость и складчатость сетчатки, а также некоторые общие трудности, включая усадку клеток и неясные ядра, могут возникать при изготовлении цельного патча сетчатки, что отрицательно сказывается на экспериментальных исследованиях. Кроме того, не все сетчатки подвергаются немедленному иммуноокрашиванию, особенно когда речь идет о сетчатке трансгенных мышей с дорогими ценами, которые имеют драгоценное происхождение, что требует сохранения дополнительных образцов сетчатки для дальнейшего использования.
Соответствующий фиксирующий раствор может быстро фиксировать ткань, избегать тканевого аутолиза, сохранять нормальную морфологию и структуру клеток ткани и сохранять антигенность белков и других веществ10. В настоящее время фиксация на основе формальдегида широко используется в различных тканях, включая разделенные сетчатки, гемисектированные наглазники и целые глазные яблоки10. Усадка тканей и морфологическое изменение клеток являются двумя критическими проблемами, возникающими после погружения в формальдегид11. Кроме того, все чаще появляются модифицированные составы фиксации, чтобы максимизировать сохранение первоначальных свойств сетчатки и клеток-мишеней 9,10. Различные методы фиксации сетчатки могут по-разному влиять на структуру сетчатки, иммуногенность белка, возбуждение флуоресценции и цикл гашения затуханиязатухания 12,13. Сетчатки, зафиксированные раствором Дэвидсона, более морфологически интактны по сравнению с сетчатками, фиксированными формалином, но раствор Дэвидсона менее совместим с некоторыми антителами, такими как ионизированная микроглиальным маркером кальций молекула адаптера 112. Учитывая хрупкую природу сетчатки, исследователи, естественно, задаются вопросом, изменится ли целостность сетчатки, а также свойства и морфология клеток-мишеней после длительного хранения. Однако о возможном влиянии фиксирующего раствора на морфологию клеток сетчатки и RGC после хранения в течение нескольких месяцев сообщалось редко. Оптимизация фиксации сетчатки имеет решающее значение для оценки и сохранения RGC.
Мы приводим подробное описание надежного и технически простого метода, который мы используем для окрашивания сетчатки мыши целиком. Наш метод подчеркивает надлежащую подготовку и хранение сетчатки для исследования RGC, принимая во внимание необходимость длительного хранения ткани сетчатки, а также специфические аспекты образования или деградации флуорофоров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фиксация является важным шагом для сохранения сетчатки, что может повлиять на любые последующие исследования RGC, основанные на морфологии. Успешная фиксация быстро фиксирует структуру и состояние сетчатки в момент воздействия на нее фиксирующей среды, что имеет решающее значение для ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Проектом открытия ключевых лабораторий провинции Хубэй (грант No 2021KFY055), Фондом естественных наук провинции Хубэй (грант No 2020CFB240) и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (грант No 2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
Riferimenti
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
