Etablering av tumörorganoider och fibroblaster från bukspottkörtelcancer från färsk vävnad
Summary
Tumörorganoider har revolutionerat cancerforskningen och tillvägagångssättet för personlig medicin. De representerar en kliniskt relevant tumörmodell som gör det möjligt för forskare att ligga steget före tumören i kliniken. Detta protokoll fastställer tumörorganoider från färska tumörvävnadsprover från bukspottkörteln och patienthärledda xenografter med ursprung i pankreasadenokarcinom.
Abstract
Tumörorganoider är tredimensionella (3D) ex vivo-tumörmodeller som rekapitulerar de biologiska nyckelegenskaperna hos de ursprungliga primära tumörvävnaderna. Tumörorganoider från patienter har använts i translationell cancerforskning och kan användas för att bedöma behandlingskänslighet och resistens, cell-cellinteraktioner och tumörcellsinteraktioner med tumörmikromiljön. Tumörorganoider är komplexa odlingssystem som kräver avancerade cellodlingstekniker och odlingsmedier med specifika tillväxtfaktorcocktails och ett biologiskt basalmembran som efterliknar den extracellulära miljön. Förmågan att etablera primära tumörkulturer beror i hög grad på ursprungsvävnaden, cellulariteten och tumörens kliniska egenskaper, såsom tumörgraden. Dessutom är insamling av vävnadsprover, materialkvalitet och kvantitet samt korrekt biobankning och förvaring avgörande delar av denna procedur. Laboratoriets tekniska kapacitet är också avgörande faktorer att ta hänsyn till. Här rapporterar vi ett validerat SOP/protokoll som är tekniskt och ekonomiskt genomförbart för odling av ex vivo tumörorganoider från färska vävnadsprover med ursprung i pankreasadenokarcinom, antingen från färsk primär resekerad patientdonatorvävnad eller patientderiverade xenografter (PDX). Tekniken som beskrivs här kan utföras i laboratorier med grundläggande vävnadsodling och musfaciliteter och är skräddarsydd för bred tillämpning inom det translationella onkologiområdet.
Introduction
Tumörorganoider är ex vivo tredimensionella (3D) organiserade kulturer som härrör från färsk tumörvävnad och ger cancermodeller. Tumörorganoider rekapitulerar de biologiska nyckelegenskaperna hos den ursprungliga primära tumören 1,2,3,4 och kan expanderas i upp till flera månader och kryokonserveras, liknande konventionella odödliga cellinjer. Tumörorganoider tillhandahåller en biobank av patienthärledda tumörmodeller för translationell/personlig medicin5 och representerar ett viktigt framsteg inom cancercellbiologiska system/modeller. Tumörorganoider från patienter kan användas som ex vivo-modeller för att förutsäga effekten av (neo)adjuvanta onkologiska/farmakologiska terapier, för vilka odlingar etableras från färsk tumörvävnad och läkemedelskänslighetsanalyser eller farmakotypning utförs på patientspecifik basis för att identifiera effektiva medel för efterföljande behandlingslinjer 1,4. Dessutom övervinner tumörorganoider begränsningen av tillgängligheten av primär tumörvävnad och, ännu viktigare, erbjuder ett utmärkt alternativ eller komplementärt system till in vivo-musmodeller, såsom patient-deriverade xenografter (PDX)2. Komplexiteten hos tumörorganoider ökar om de primära tumörcellerna kombineras med stromaceller som finns i tumörmikromiljön (TME), såsom cancerassocierade fibroblaster (CAF), endotelceller och immunceller, som efterliknar primärtumörens funktion och komplexa cellularitet. Tumörorganoider har fastställts för många tumörtyper med hjälp av standardiserade protokoll 6,7,8,9,10. Organoidförökning från olika solida tumörer, inklusive kolorektal och bröstcancervävnad, är väletablerad och tekniskt överkomlig 11,12,13,14,15.
Kirurgiska tumörresektioner eller tumörbiopsier ger primära tumörvävnadsprover. Helst bör tumörvävnadsprover komma från mitten av tumörmassan eller den invaderande kanten av tumören, såväl som vävnad som ser normal ut intill tumören. Jämfört med konventionella 2D-kulturer kräver tumörorganoider flera “tillägg”, inklusive ett biologiskt basalmembran (t.ex. Matrigel, hydrogel eller en kollagenbaserad struktur), som efterliknar den extracellulära TME, och ett flytande tillväxtmedium som tillför specifika näringsämnen och tillväxtfaktorer och stöder cellproliferation och livskraft i odling16.
De mest grundläggande stegen i primär cellodling är att tvätta vävnaden i saltlösning för att förhindra kontaminering, mekaniskt skära/smälta tumören i små bitar på 1-3 mm3 och behandla med kollagenas för enzymatisk nedbrytning av vävnaden. Den smälta blandningen filtreras sedan för att avlägsna stora vävnadsfragment, återsuspenderas i ett biologiskt basalmembran såsom Matrigel och pläteras som kupoler i odlingsplattor med låg fästförmåga för att förbättra tillväxten av icke-fäst. Basalmembranmatriskupolerna är täckta med flytande odlingsmedium och kompletteras med glutamin och antibiotika för att undvika kontaminering, samt med specifika tillväxtfaktorer beroende på vävnadstyp 7,8,9,16,17. Andra relevanta celler som finns i bulktumören och TME kan också isoleras, t.ex. cancerassocierade fibroblaster (CAF) och immunceller. Denna teknik, som nyligen har granskats18, gör det möjligt att etablera samkulturer med olika celltyper för att studera svaret på terapi i en mer “realistisk” tumörmiljö. Vidare kan cell-cellinteraktioner och interaktionen mellan tumörceller och komponenter i den omgivande biologiska matrisen studeras.
Den rapporterade framgångsfrekvensen för tumörorganoidetablering med hjälp av färsk vävnad från biopsier eller resekerad gastrointestinal tumörvävnad är cirka 50 %11, och framgångsfrekvensen från den senare är till stor del beroende av vävnadstyp och ursprung4, särskilt tumörgraden och den övergripande tumörcellulariteten. Tredimensionella tumörmodeller har varierande komplexitet, från enkla encelliga aggregat till mycket komplexa konstruerade modeller bestående av olika celltyper. Terminologin som används för att beskriva 3D-kulturer i litteraturen är mycket inkonsekvent 19,20,21, eftersom olika termer som sfäroider, tumörsfärer och organoider används, även om skillnaden mellan dem är oklar. Eftersom en tydlig konsensus om definitionen ännu inte har nåtts, beskrivs i denna artikel en tumörorganoid som en organiserad tumörcellkultur inbäddad i ett biologiskt basalmembran.
Häri rapporteras ett validerat protokoll för etablering av tumörorganoider från färska vävnadsprover som härrör från färskt primärt resekerat eller PDX-härlett pankreasduktalt adenokarcinom (PDAC), och detta protokoll kan utföras i de flesta laboratorier med grundläggande vävnadsodlingsanläggningar. Detta protokoll har anpassats från flera state-of-the-art rapporterade protokoll som för närvarande används för att etablera tumörorganoider eller tumöroider från matsmältningstumörvävnad från grupperna David Tuveson9, Hans Clevers8 och Aurel Perren7.
Detta protokoll diskuterar inte hur den färska vävnaden skördas. För att få färsk mänsklig tumörvävnad av hög kvalitet är det viktigt att ha en effektiv samordning mellan kirurgerna som skördar vävnaden och patologiavdelningen som extraherar vävnadsprovet för organoidodling. På samma sätt, när man använder PDX som en färsk vävnadskälla, är effektiv samordning med den person som skördar vävnadsprovet också viktigt. Det är viktigt att få vävnadsprovet så snabbt som möjligt (inom 30-60 minuter från skördetillfället) för att bibehålla en hög kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stora framsteg inom farmakologiska cancerbehandlingar är utmanande, eftersom sannolikheten för godkännande av läkemedel i kliniska fas I-prövningar inom onkologi är 5,1 %, vilket är den lägsta av alla sjukdomstyper23. Den främsta orsaken är att cancer är mycket heterogent, och därför svarar patientkohorterna inte enhetligt som förväntat på den givna behandlingen, vilket belyser att ett mer personligt tillvägagångssätt behövs. Tvådimensionella (2D) kulturer har använts inom tr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av finansiering från Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för bidragsavtal nr 857381, projektet VISION (Strategier för att stärka vetenskaplig excellens och innovationskapacitet för tidig diagnos av gastrointestinal cancer), Intramural utlysning för nya forskningsprojekt för kliniska forskare och framväxande forskargrupper IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) och TRANSCAN II-projektet JTC 2017 utlysning “Establishing an algorithm for the early diagnosis and follow-up of patients with pancreatic neuroendocrine tumours (NExT)”, anslagsnummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologiska proverna som används i detta protokoll tillhandahölls av BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) och integrerades i ISCIII:s biobanks- och biomodellplattform (PT20/00045). Vi vill också tacka Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita och Thorsten Knoll för deras ovärderliga stöd för att utveckla detta protokoll som en del av NExT- och VISION-projekten.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
Riferimenti
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
