בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

Summary

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. מטרת כתב היד היא להציג שיטה להערכת יכולות הפאגוציטוזה והפינוי של מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי המגורות באמצעות Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

מקרופאגים מהווים קו הגנה חיוני ואחראים למניעת גדילה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. פגוציטוזה קונידיאלית היא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים הציטופלזמיים והמולקולריים המעורבים באינטראקציות מקרופאגים-פתוגנים, כמו גם לקביעת זמן המוות של קונידיה מופנמת. הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. התחמקות מפאגוציטוזה ובריחה של פגוזומים הם מנגנונים של אלימות פטרייתית. כאן, אנו מדווחים על השיטות שניתן להשתמש בהן לניתוח של phagocytosis, סליקה, ואת הכדאיות של T. stromaticum conidia, פטרייה אשר משמש biocontrol ו biofertilizer סוכן והוא מסוגל לגרום זיהומים אנושיים. הפרוטוקול מורכב מ-1) תרבית טריכודרמה (Trichoderma ), 2) שטיפה להשגת קונידיה (conidia), 3) בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בשיטת תמיסת רב-סוכרוז והתמיינות ה-PBMCs למקרופאגים, 4) שיטת פאגוציטוזה חוץ-גופית באמצעות כיסויי זכוכית עגולים וצבע, ו-5) בדיקת פינוי להערכת הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה של קונידיה. לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי למדוד את יעילות פינוי הפטריות של מקרופאגים.

Introduction

סוג טריכודרמה (סדר: Hypocreales, משפחה: Hypocreaceae) מורכב מפטריות ספרופיטיות הנמצאות בכל מקום, שהן טפילים של מיני פטריות אחרים ומסוגלות לייצר מגוון אנזימים שימושיים מסחרית¹. מיני פטריות אלה משמשים לייצור חלבונים הטרולוגיים², לייצור תאית³, אתנול, בירה, יין ונייר⁴, בתעשיית הטקסטיל⁵, בתעשיית המזון⁶, ובחקלאות כסוכני הדברה ביולוגית ^7,8. בנוסף להתעניינות התעשייתית במינים פטרייתיים אלה, המספר ההולך וגדל של זיהומים בבני אדם העניק לחלק ממיני הטריכודרמה מעמד של פתוגנים אופורטוניסטיים⁹.

Trichoderma spp. גדלים במהירות בתרבות, עם מושבות לבנות וכותנות בתחילה שהופכות צהוב ירקרק לירוק כהה¹⁰. הם מותאמים לחיות במגוון רחב של תנאי pH וטמפרטורה, והמינים האופורטוניסטיים מסוגלים לשרוד ב- pH פיזיולוגי ובטמפרטורות ובכך ליישב רקמות אנושיות שונות 11,12,13. חשוב לציין, העלייה בשיעור הזיהום של Trichoderma spp. עשויה להיות קשורה לגורמי אלימות, ואלה אינם נחקרים היטב. בנוסף, מחקרים המתמקדים בהבנת התגובה החיסונית נגד מיני טריכודרמה אופורטוניסטיים הם עדיין נדירים.

במהלך זיהום, יחד עם נויטרופילים, מקרופאגים מייצגים את קו ההגנה האחראי לפאגוציטוזה, ובכך מונעים צמיחה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. באמצעות שימוש בקולטנים לזיהוי דפוסים, כגון קולטנים דמויי טול וקולטני לקטין מסוג C, פטריות פאגוציטוזה של מקרופאגים ועיבודן לפגוליזוזומים, ובכך קידום התפרצות נשימתית, שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת והרס מיקרואורגניזמים פגוציטוזים¹⁴. מנגנון הפאגוציטוזה, לעומת זאת, יכול להיות מושפע ולהתחמק על ידי אסטרטגיות מיקרוביאליות שונות, כגון גודל וצורה של תאים פטרייתיים; נוכחות של כמוסות המעכבות phagocytosis; הפחתת מספר הקולטנים הגורמים לפאגוציטוזה; שיפוץ המבנה של סיבי אקטין בציטופלסמה; מעכב את היווצרות pseudopodia; ופאגוזום או פאגוליזוזום בורחים לאחר תהליך הפאגוציטוזה¹⁴.

פתוגנים רבים, כולל Cryptococcus neoformans, משתמשים במקרופאגים כנישה לשרוד בפונדקאי, להפיץ ולגרום לזיהום¹⁵. בדיקת הפאגוציטוזה והפינוי משמשת להערכת התגובה החיסונית נגד פתוגנים ולזיהוי האסטרטגיות המיקרוביאליות המשמשות להתחמקות ממערכת החיסון המולדת 15,16,17. סוג זה של טכניקה יכול לשמש גם כדי לבחון את הקינטיקה הדיפרנציאלית של phagocytosis, החמצה מאוחרת phagosome, פרץ חמצוני שתוצאתם הרג פטרייתי מופחת¹⁸.

ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להעריך פגוציטוזה, הישרדות פטרייתית והתחמקות מתהליך ההבשלה של הפאגוזומים. אלה כוללים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המשמשת לצפייה בפאגוציטוזה, במיקום התא ובמולקולות המיוצרות במהלך פגוציטוזה¹⁹; ציטומטריית זרימה, המספקת נתונים כמותיים על פגוציטוזה ומשמשת להערכת הסמנים השונים המעורבים בתהליך^20,21; מיקרוסקופיה תוך חיונית, המשמשת להערכת לכידת חיידקים והבשלת פגוזום²²; פגוציטוזה בתיווך נוגדנים, המשמשת להערכת הספציפיות של תהליך הפאגוציטוזה עבור פתוגן²³; ואחרים 24,25,26,27.

הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בשיטה נפוצה, זולה וישירה באמצעות מיקרוסקופ אופטי ובדיקת צמיחת לוחות כדי להעריך את הפאגוציטוזה וההרג של קונידיה פטרייתית. פרוטוקול זה יספק לקוראים הוראות שלב אחר שלב לביצוע בדיקת פאגוציטוזה וסילוק באמצעות מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי שנחשפו ל- T. stromaticum. PBMCs שימשו מכיוון ש – Trichoderma conidia מיושמים כהדברה ביולוגית נגד פיטופתוגנים ודשן ביולוגי לגידולי צמחים ברחבי העולם וגרמו למספר זיהומים בבני אדם, הנקראים Trichodermosis. מלבד זאת, יש רק שתי עבודות קודמות המתמקדות באינטראקציה בין Trichoderma conidia לבין מערכת החיסון האנושית, שבהן בחנו נויטרופילים²⁸ ואוטופגיה במקרופאגים²⁹. מאמר זה מראה תחילה כיצד ניתן לחקור את הפאגוציטוזה של הקונידיה של T. stromaticum על ידי מקרופאגים שמקורם ב-PBMC, ולאחר מכן כיצד ניתן להעריך את הכדאיות של הקונידיה הנבלעת באמצעות טכניקות פשוטות המבוססות על מיקרוסקופיה. פרוטוקול זה עשוי להקל עוד יותר על חקירות של תגובה חיסונית הקשורה למקרופאגים או מנגנונים הקשורים לאפנון מערכת החיסון.

Protocol

שיקולים אתיים ונושאים אנושייםכל הניסויים בבני אדם המתוארים במחקר זה נערכו על פי הצהרת הלסינקי והחוקים הפדרליים של ברזיל ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת המדינה של סנטה קרוז (קוד זיהוי הפרויקט: 550.382/ 2014). דם היקפי אנושי נאסף ממתנדבים בריאים מהעיר איליאוס בב…

Representative Results

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. השתמשנו בפאגוציטוזה של T. stromaticum conidia כדי להעריך את הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה, שכן התחמקות מפאגוציטוזה ובריחת פגוזומים הם מנגנונים של אלימ?…

Discussion

עבור מספר פתוגנים פטרייתיים, כולל Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans, ואחרים, phagocytosis conidial או שמרים הוא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים cytoplasmic ומולקולרי באינטראקציות מקרופאג פתוגן, כמו גם לקביעת זמן המוות של conidia^{מופנם 14,39,40}. פג…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.