Saggio di vitalità dei conidi di Trichoderma stromaticum all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano

Summary

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per valutare la fagocitosi e le capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano stimolati con Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

I macrofagi rappresentano una linea di difesa cruciale e sono responsabili della prevenzione della crescita e della colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. La fagocitosi conidiale è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari coinvolti nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento di morte dei conidi internalizzati. La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. L’evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. Di seguito, riportiamo i metodi che possono essere utilizzati per l’analisi della fagocitosi, della clearance e della vitalità di T. stromaticum conidia, un fungo che viene utilizzato come agente di biocontrollo e biofertilizzante ed è in grado di indurre infezioni umane. Il protocollo consiste in 1) coltura di Trichoderma , 2) lavaggio per ottenere conidi, 3) isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando il metodo della soluzione di polisaccarosio e la differenziazione delle PBMC in macrofagi, 4) un metodo di fagocitosi in vitro utilizzando vetrini coprioggetti rotondi e colorazione e 5) un test di clearance per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi dei conidi. In sintesi, queste tecniche possono essere utilizzate per misurare l’efficienza di eliminazione fungina dei macrofagi.

Introduction

Il genere Trichoderma (Ordine: Hypocreales, Famiglia: Hypocreaceae) è composto da funghi saprofiti ubiquitari che sono parassiti di altre specie fungine e sono in grado di produrre una serie di enzimi commercialmente utili¹. Queste specie fungine sono utilizzate per la produzione di proteine eterologhe², la produzione di cellulosa³, etanolo, birra, vino e carta⁴, nell’industria tessile⁵, nell’industria alimentare⁶ e in agricoltura come agenti di controllo biologico ^7,8. Oltre all’interesse industriale per queste specie fungine, il crescente numero di infezioni nell’uomo ha conferito ad alcune specie di Trichoderma lo status di patogeni opportunisti⁹.

Trichoderma spp. cresce rapidamente in coltura, con colonie inizialmente bianche e cotonose che virano dal giallo verdastro al verde scuro¹⁰. Sono adattati a vivere in un’ampia gamma di condizioni di pH e temperatura, e le specie opportuniste sono in grado di sopravvivere a pH e temperature fisiologiche e, quindi, colonizzare diversi tessuti umani 11,12,13. È importante sottolineare che l’aumento del tasso di infezione da Trichoderma spp. può essere associato a fattori di virulenza e questi non sono ben studiati. Inoltre, gli studi incentrati sulla comprensione della risposta immunitaria contro le specie opportuniste di Trichoderma sono ancora rari.

Durante un’infezione, insieme ai neutrofili, i macrofagi rappresentano la linea di difesa responsabile della fagocitosi e, quindi, impediscono la crescita e la colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. Utilizzando recettori di riconoscimento di pattern, come i recettori Toll-like e i recettori della lectina di tipo C, i macrofagi fagocitano i funghi e li trasformano in fagolisosomi, promuovendo così un’esplosione respiratoria, il rilascio di citochine pro-infiammatorie e la distruzione dei microrganismi fagocitati¹⁴. Il meccanismo della fagocitosi, tuttavia, può essere influenzato ed eluso da diverse strategie microbiche, come la dimensione e la forma delle cellule fungine; la presenza di capsule che ostacolano la fagocitosi; diminuzione del numero di recettori che inducono la fagocitosi; il rimodellamento della struttura delle fibre di actina nel citoplasma; ostacolare la formazione di pseudopodi; e il fagosoma o il fagolisosoma fuoriescono dopo il processo di fagocitosi¹⁴.

Molti agenti patogeni, tra cui il Cryptococcus neoformans, usano i macrofagi come nicchia per sopravvivere nell’ospite, disseminarsi e indurre l’infezione¹⁵. Il saggio di fagocitosi e clearance viene utilizzato per valutare la risposta immunitaria contro i patogeni e per identificare le strategie microbiche impiegate per eludere il sistema immunitario innato 15,16,17. Questo tipo di tecnica può anche essere utilizzata per esaminare la cinetica differenziale della fagocitosi, dell’acidificazione ritardata dei fagosomi e dell’esplosione ossidativa che si traducono in una riduzione dell’uccisione fungina¹⁸.

Diversi metodi possono essere utilizzati per valutare la fagocitosi, la sopravvivenza fungina e l’evasione del processo di maturazione del fagosoma. Questi includono la microscopia a fluorescenza, che viene utilizzata per osservare la fagocitosi, la posizione cellulare e le molecole prodotte durante la fagocitosi¹⁹; citometria a flusso, che fornisce dati quantitativi sulla fagocitosi e viene utilizzata per valutare i diversi marcatori coinvolti nel processo^20,21; microscopia intravitale, che viene utilizzata per valutare la cattura microbica e la maturazione dei fagosomi²²; fagocitosi mediata da anticorpi, che viene utilizzata per valutare la specificità del processo di fagocitosi per un patogeno²³; e altri 24,25,26,27.

Il protocollo qui presentato impiega un metodo comune, a basso costo e diretto che utilizza un microscopio ottico e un saggio di crescita su piastra per valutare la fagocitosi e l’uccisione dei conidi fungini. Questo protocollo fornirà ai lettori istruzioni dettagliate per l’esecuzione del saggio di fagocitosi e clearance utilizzando macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano esposti a T. stromaticum. I PBMC sono stati utilizzati perché i conidi di Trichoderma sono applicati come biocontrollo contro i fitopatogeni e come biofertilizzante per le colture vegetali in tutto il mondo e hanno causato diverse infezioni umane, chiamate Trichodermosis. Oltre a ciò, ci sono solo due lavori precedenti incentrati sull’interazione tra Trichoderma conidi e il sistema immunitario umano, in cui abbiamo esaminato i neutrofili²⁸ e l’autofagia nei macrofagi²⁹. Questo articolo mostra in primo luogo come la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum da parte di macrofagi derivati da PBMC possa essere studiata, e poi come la vitalità dei conidi inghiottiti possa essere valutata utilizzando semplici tecniche basate sulla microscopia. Questo protocollo può facilitare ulteriormente le indagini sulla risposta immunitaria associata ai macrofagi o sui meccanismi correlati alla modulazione del sistema immunitario.

Protocol

Considerazioni etiche e soggetti umaniTutti gli esperimenti con gli esseri umani descritti in questo studio sono stati condotti secondo la Dichiarazione di Helsinki e le leggi federali brasiliane e approvati dal Comitato Etico dell’Università Statale di Santa Cruz (codice di identificazione del progetto: 550.382/2014). Il sangue periferico umano è stato raccolto da volontari sani della città di Ilhéus, Bahia, Brasile, non esposti ad attività lavorative legate al fungo…

Representative Results

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Abbiamo utilizzato la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi, poiché l’evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. I ricercatori dovrebbero eseguire queste tecniche come uno dei primi saggi quando studiano una specie …

Discussion

Per diversi patogeni fungini, tra cui Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans e altri, la fagocitosi conidiale o del lievito è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento della morte dei conidi internalizzati 14,39,40. La fagocitosi è il processo chiave nell’interazione Tri…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.