Ensaio de viabilidade de conídios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados do sangue periférico humano

Summary

A técnica envolvendo a fagocitose de conídios fúngicos por macrófagos é amplamente utilizada para estudos avaliando a modulação da resposta imune contra fungos. O objetivo deste artigo é apresentar um método para avaliar a fagocitose e a capacidade de depuração de macrófagos mononucleares de sangue periférico humano estimulados com conídios de Trichoderma stromaticum .

Abstract

Os macrófagos representam uma linha de defesa crucial e são responsáveis por prevenir o crescimento e a colonização de patógenos em diferentes tecidos. A fagocitose de conídios é um processo chave que permite a investigação dos eventos citoplasmáticos e moleculares envolvidos nas interações macrófagos-patógenos, bem como a determinação do tempo de morte de conídios internalizados. A técnica envolvendo a fagocitose de conídios fúngicos por macrófagos é amplamente utilizada para estudos avaliando a modulação da resposta imune contra fungos. A evasão da fagocitose e o escape dos fagossomos são mecanismos de virulência fúngica. Neste trabalho, relatamos os métodos que podem ser utilizados para a análise da fagocitose, depuração e viabilidade de conídios de T. stromaticum , um fungo que é usado como agente de biocontrole e biofertilizante e é capaz de induzir infecções humanas. O protocolo consiste em: 1) cultura de Trichoderma , 2) lavagem para obtenção de conídios, 3) isolamento de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) pelo método da solução de polissacarose e diferenciação das CMSP em macrófagos, 4) método de fagocitose in vitro utilizando lamínulas de vidro redondo e coloração, e 5) ensaio de depuração para avaliar a viabilidade dos conídios após fagocitose dos conídios. Em resumo, essas técnicas podem ser usadas para medir a eficiência da depuração fúngica de macrófagos.

Introduction

O gênero Trichoderma (Ordem: Hypocreales, Família: Hypocreaceae) é composto por fungos ubíquos e saprofíticos, parasitas de outras espécies fúngicas e capazes de produzir uma variedade de enzimas comercialmente úteis¹. Essas espécies fúngicas são utilizadas para a produção de proteínas heterólogas², produção de celulose³, etanol, cerveja, vinho e papel⁴, na indústria têxtil⁵, na indústria alimentícia⁶ e na agricultura como agentes de controle biológico ^7,8. Além do interesse industrial nessas espécies fúngicas, o crescente número de infecções em humanos tem conferido a algumas espécies de Trichoderma o status de patógenos oportunistas⁹.

cresce rapidamente em cultura, com colônias inicialmente brancas e cotonosas que se tornam amarelo-esverdeadas a verde-escuras¹⁰. Eles são adaptados para viver em uma ampla gama de condições de pH e temperatura, e as espécies oportunistas são capazes de sobreviver a pH e temperaturas fisiológicas e, assim, colonizar diferentes tecidos humanos 11,12,13. É importante ressaltar que o aumento na taxa de infecção de Trichoderma spp pode estar associado a fatores de virulência, que não são bem estudados. Além disso, estudos focados no entendimento da resposta imune contra espécies oportunistas de Trichoderma ainda são escassos.

Durante uma infecção, juntamente com os neutrófilos, os macrófagos representam a linha de defesa responsável pela fagocitose e, assim, impedem o crescimento e a colonização de patógenos em diferentes tecidos. Utilizando receptores de reconhecimento padrão, como receptores Toll-like e receptores de lectina tipo C, os macrófagos fagocitam fungos e os processam em fagolisossomos, promovendo burst respiratório, liberação de citocinas pró-inflamatórias e destruição dos microrganismos fagocitados¹⁴. O mecanismo de fagocitose, entretanto, pode ser afetado e evitado por diferentes estratégias microbianas, tais como o tamanho e a forma das células fúngicas; a presença de cápsulas que dificultam a fagocitose; diminuição do número de receptores indutores de fagocitose; a remodelação da estrutura das fibras de actina no citoplasma; dificultar a formação de pseudopódios; e escape do fagossomo ou fagolisossomo após o processo de fagocitose¹⁴.

Muitos patógenos, incluindo o Cryptococcus neoformans, utilizam macrófagos como nicho para sobreviver no hospedeiro, disseminar e induzir infecção¹⁵. O ensaio de fagocitose e depuração é utilizado para avaliar a resposta imune contra patógenos e identificar as estratégias microbianas empregadas para evadir o sistema imune inato 15,16,17. Esse tipo de técnica também pode ser usado para examinar a cinética diferencial de fagocitose, acidificação retardada do fagossomo e explosão oxidativa que resultam em redução da morte fúngica¹⁸.

Diferentes métodos podem ser utilizados para avaliar a fagocitose, a sobrevivência fúngica e a evasão do processo de maturação do fagossomo. Entre elas estão a microscopia de fluorescência, que é utilizada para observar a fagocitose, a localização celular e as moléculas produzidas durante a fagocitose¹⁹; a citometria de fluxo, que fornece dados quantitativos sobre a fagocitose e é utilizada para avaliar os diferentes marcadores envolvidos no^{processo20,21}; microscopia intravital, que é utilizada para avaliar a captura microbiana e a maturação do^fagossomo22; fagocitose mediada por anticorpos, que é usada para avaliar a especificidade do processo de fagocitose para um patógeno²³; e outros 24,25,26,27.

O protocolo aqui apresentado emprega um método comum, de baixo custo e direto, usando microscópio óptico e ensaio de crescimento em placa para avaliar a fagocitose e a morte de conídios fúngicos. Este protocolo fornecerá aos leitores instruções passo a passo para a realização do ensaio de fagocitose e depuração utilizando macrófagos mononucleares de sangue periférico humano expostos ao T. stromaticum. As CMSP foram utilizadas porque os conídios de Trichoderma são aplicados como biocontrole contra fitopatógenos e biofertilizante para culturas vegetais em todo o mundo e têm causado diversas infecções humanas, denominadas Tricodermoses. Além disso, existem apenas dois trabalhos anteriores enfocando a interação entre conídios de Trichoderma e o sistema imunológico humano, nos quais examinamos neutrófilos²⁸ e autofagia em macrófagos²⁹. Este artigo mostra primeiramente como a fagocitose dos conídios de T. stromaticum por macrófagos derivados de CMSP pode ser estudada e, em seguida, como a viabilidade dos conídios engolidos pode ser avaliada usando técnicas simples baseadas em microscopia. Esse protocolo pode facilitar ainda mais as investigações sobre a resposta imune associada a macrófagos ou mecanismos relacionados à modulação do sistema imune.

Protocol

Considerações éticas e sujeitos humanosTodos os experimentos com humanos descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e as leis federais brasileiras e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Estadual de Santa Cruz (código de identificação do projeto: 550.382/ 2014). O sangue periférico humano foi coletado de voluntários saudáveis da cidade de Ilhéus, Bahia, Brasil, não expostos a atividades ocupacionais relacionadas …

Representative Results

A técnica envolvendo a fagocitose de conídios fúngicos por macrófagos é amplamente utilizada para estudos avaliando a modulação da resposta imune contra fungos. Utilizamos a fagocitose de conídios de T. stromaticum para avaliar a viabilidade dos conídios após fagocitose, uma vez que a evasão da fagocitose e o escape dos fagossomos são mecanismos de virulência fúngica. Os pesquisadores devem realizar essas técnicas como um dos primeiros ensaios ao investigar uma espécie de interesse clínico. …

Discussion

Para vários patógenos fúngicos, incluindo Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans e outros, a fagocitose de conídios ou leveduras é um processo chave que permite a investigação de eventos citoplasmáticos e moleculares nas interações macrófagos-patógenos, bem como a determinação do tempo de morte dos conídios internalizados 14,39,40. A fagocitose é o processo-chave na inter…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.