Saggio di vitalità dei conidi di Trichoderma stromaticum all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano

Sommario

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per valutare la fagocitosi e le capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano stimolati con Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

I macrofagi rappresentano una linea di difesa cruciale e sono responsabili della prevenzione della crescita e della colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. La fagocitosi conidiale è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari coinvolti nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento di morte dei conidi internalizzati. La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. L'evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. Di seguito, riportiamo i metodi che possono essere utilizzati per l'analisi della fagocitosi, della clearance e della vitalità di T. stromaticum conidia, un fungo che viene utilizzato come agente di biocontrollo e biofertilizzante ed è in grado di indurre infezioni umane. Il protocollo consiste in 1) coltura di Trichoderma , 2) lavaggio per ottenere conidi, 3) isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando il metodo della soluzione di polisaccarosio e la differenziazione delle PBMC in macrofagi, 4) un metodo di fagocitosi in vitro utilizzando vetrini coprioggetti rotondi e colorazione e 5) un test di clearance per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi dei conidi. In sintesi, queste tecniche possono essere utilizzate per misurare l'efficienza di eliminazione fungina dei macrofagi.

Introduzione

Il genere Trichoderma (Ordine: Hypocreales, Famiglia: Hypocreaceae) è composto da funghi saprofiti ubiquitari che sono parassiti di altre specie fungine e sono in grado di produrre una serie di enzimi commercialmente utili¹. Queste specie fungine sono utilizzate per la produzione di proteine eterologhe², la produzione di cellulosa³, etanolo, birra, vino e carta⁴, nell'industria tessile⁵, nell'industria alimentare⁶ e in agricoltura come agenti di controllo biologico ^7,8.

Protocollo

Considerazioni etiche e soggetti umani
Tutti gli esperimenti con gli esseri umani descritti in questo studio sono stati condotti secondo la Dichiarazione di Helsinki e le leggi federali brasiliane e approvati dal Comitato Etico dell'Università Statale di Santa Cruz (codice di identificazione del progetto: 550.382/2014).

Il sangue periferico umano è stato raccolto da volontari sani della città di Ilhéus, Bahia, Brasile, non esposti ad attività lavorative legate al fungo studiato. Sono stati esclusi gli individui con condizioni mediche di salute segnalate o che fanno uso di farmaci. Tutti i soggetti hanno accettato volonta....

Risultati

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Abbiamo utilizzato la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi, poiché l'evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. I ricercatori dovrebbero eseguire queste tecniche come uno dei primi saggi quando studiano una specie di .......

Discussione

Per diversi patogeni fungini, tra cui Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans e altri, la fagocitosi conidiale o del lievito è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento della morte dei conidi internalizzati 14,39,40. La fagocitosi è il processo chiave nell'interazione Tricho.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette da centrifuga da 15 mL	Corning	CLS431470	Provette da centrifuga da 15 mL, polipropilene, fondo conico con coperchio, sterili singolarmente
Piastra per coltura cellulare a fondo piatto a 24 pozzetti	Kasvi	K12-024	Realizzato in polistirene con identificazione alfanumerica; La piastra per colture cellulari è priva di DNasi, RNasi e pirogeni e priva di sostanze citotossiche; Sterilizzato con radiazioni gamma;
Incubatore CO2 per colture cellulari	Sanyo	303082	Un incubatore a CO2 serve a creare e controllare condizioni simili a quelle di un corpo umano, consentendo così la crescita e la proliferazione in vitro di diversi tipi di cellule.
Microprovetta da centrifuga (tipo eppendorf) 1,5 mL	Capp	5101500	Realizzata in polipropilene, con tappo attaccato alla provetta per l'apertura e la chiusura con una sola mano. Ha un interno lucidato contro l'adesione delle proteine e per la visibilità del campione, essendo privo di DNasi, RNasi e pirogeni Vetrino
coprioggetti circolare 15 mm	Olen	K5-0015	I vetrini coprioggetti circolari sono utilizzati per le tecniche di microscopia nelle colture cellulari. Realizzato in vetro traslucido super trasparente; con spessore di 0,13 mm
Classe II Tipo B2 (scarico totale) Cabine di biosicurezza	Esco Lifesciences gruppo	2010274	Airstream Classe II Tipo B2 Le cappe di biosicurezza (AB2) forniscono protezione del prodotto, dell'operatore e dell'ambiente e sono adatte per lavorare con tracce di sostanze chimiche tossiche e agenti assegnati ai livelli di sicurezza biologica I, II o III. In un armadio di Classe II di Tipo B2, tutta l'aria in entrata e in discesa viene scaricata dopo la filtrazione HEPA/ULPA nell'ambiente esterno senza ricircolo sulla superficie di lavoro.
Destrosio Agar di patata medio	Merck	145	Patata L'agar destrosio è utilizzato nella coltivazione e nel conteggio di lieviti e funghi
Provetta per prelievo di sangue sottovuoto EDTA	FirstLab	FL5-1109L	EDTA è l'anticoagulante raccomandato per le routine ematologiche in quanto è il miglior anticoagulante per preservare la morfologia cellulare.
Entellan	Merck	1.07961	Agente fissativo; Entellan è un mezzo di montaggio senz'acqua per il montaggio permanente per microscopia.
Siero fetale bovino	Gibco	A2720801	Il siero fetale bovino (FBS) è un  Integratore universale per la crescita di terreni di coltura cellulare e tissutale. L'FBS è un cocktail naturale della maggior parte dei fattori necessari per l'attaccamento, la crescita e la proliferazione cellulare, efficace per la maggior parte dei tipi di cellule umane e animali (compresi gli insetti).
Flaticon			database di immagini
Glicerolo	Merck	24900988 L'agente	crioprotettore glicerolo viene utilizzato per il congelamento di cellule e spore
polisaccarosio	Histopaque-1077
Immagine J			Software di analisi delle immagini
Vetrini per microscopia	Precision	7105	Vetrino per microscopia 26 x 76 mm Opaco Spessore lappato da 1,0 a 1,2 mm. Realizzato in vetro ottico speciale e confezionato con divisore in carta seta con trasparenza di alta qualità priva di imperfezioni
Mini centrifuga	Prisma	C1801	La mini centrifuga Prism è stata progettata per essere estremamente compatta con un ingombro eccezionalmente ridotto. Include 2 rotori intercambiabili a sgancio rapido che girano fino a 6000 giri/min. Un freno elettronico fornisce una rapida decelerazione e il coperchio ad apertura automatica consente un facile accesso al campione, riducendo i tempi di manipolazione.
Camera Neubauer	Kasvi	K5-0011	La camera di conteggio Neubauer viene utilizzata per il conteggio di celle o altre particelle sospese.
Veloce panottico	Laborclin	620529	Laborclin's panoptic fast c è un kit per la colorazione rapida in ematologia
Soluzione di penicillina/streptomicina - 10.000U	LGC- Biotecnologia	BR3011001	viene utilizzato per evitare possibili contaminazioni da manipolazioni esterne al flusso laminare.
Piastra Petri 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Piastra Petri monouso; Realizzato in polistirene (PS) altamente trasparente; fondo piatto; Liscio; Dimensioni: 90 x 15 mm.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS è una soluzione salina a base acquosa con una formulazione semplice. È isotonico e non tossico per la maggior parte delle cellule. Include tampone cloruro di sodio e fosfato ed è formulato per prevenire lo shock osmotico mantenendo l'equilibrio idrico delle cellule viventi.
Pipetta Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTA con capacità di 3 mL, realizzata in polietilene trasparente a bassa densità (LDPE) e centrifuga
refrigerata	Thermo Scientific	TS-HM16R	La centrifuga refrigerata Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R è una centrifuga refrigerata con il pannello di controllo di facile utilizzo che facilita la preimpostazione della velocità, del valore RCF, tempo di esecuzione,  temperatura e profilo di marcia. Il Megafuge 16R può raggiungere velocità massime di  15.200 giri/min e RCF massimo di 25.830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, con L-glutammina e 25 mM HEPES, senza bicarbonato di sodio, in polvere, adatto per colture cellulari
Le micropipette a canale singolo	Eppendorf	Z683809	Le micropipette a canale singolo sono utilizzate per trasferire e misurare con precisione quantità molto piccole di liquidi.
Puntale per Micropipettatore	Corning	4894	Capacità di 10 &; micro; L e 1.000 µ L
Microscopio invertito trioculare	LABOMED	VU-7125500	Permette di osservare le cellule all'interno di provette e flaconi, senza doverle aprire, evitando così problemi di contaminazione.

Soluzione di antibiotico sterile singolarmente autoclavabile