En prosedyre for mus dorsal root ganglion kryoseksjonering
Summary
Presentert her er utviklingen for konsekvent å anskaffe høykvalitets dorsalrot ganglion kryostatseksjoner.
Abstract
Høykvalitets mus dorsal root ganglion (DRG) kryostatseksjoner er avgjørende for riktig immunkjemifarging og RNAscope-studier i forskningen av inflammatorisk og nevropatisk smerte, kløe, så vel som andre perifere nevrologiske tilstander. Det er imidlertid fortsatt en utfordring å konsekvent oppnå høy kvalitet, intakte og flate kryostatseksjoner på glassglass på grunn av den lille prøvestørrelsen på DRG-vevet. Så langt er det ingen artikkel som beskriver en optimal protokoll for DRG-kryoseksjonering. Denne protokollen presenterer en trinnvis metode for å løse de ofte oppståtte vanskelighetene forbundet med DRG-kryoseksjonering. Den presenterte artikkelen forklarer hvordan du fjerner den omkringliggende væsken fra DRG-vevsprøvene, plasserer DRG-seksjonene på lysbildet mot samme retning og flater seksjonene på glasslysbildet uten å bøye seg. Selv om denne protokollen er utviklet for kryoseksjonering av DRG-prøvene, kan den brukes til kryoseksjonering av mange andre vev med liten prøvestørrelse.
Introduction
Dorsal root ganglion (DRG) inneholder de primære sensoriske nevronene, vevsmakrofagene og satellittcellene som omgir de primære sensoriske nevronene 1,2,3,4. Det er en viktig anatomisk struktur i behandling av uskyldige og skadelige signaler, og spiller kritiske roller i smerte, kløe og ulike perifere nervesykdommer 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Selv om flere metoder har blitt utviklet for å dissekere DRG-vev fra musens ryggmarg14,15,16, er kryoseksjonering av DRG-vevet fortsatt utfordrende da DRG-vevet er ganske lite, og kryostatseksjoner av DRG-prøver har en tendens til å bøye seg i ruller, noe som gjør det vanskelig å overføre kryostatseksjonene på riktig måte på glassglass. Imidlertid er riktig kryoseksjonering av DRG-vevet avgjørende for immunhistokjemiske studier og strukturen til DRG sensoriske nevroner 17,18,19,20,21,22,23. Videre, ettersom enkeltcelle RNA-sekvenseringsresultater har avslørt den bemerkelsesverdige heterogeniteten til DRG-sensoriske nevroner hos både mennesker24 og mus25, er riktig kryoseksjonering av DRG-vev avgjørende for å undersøke den funksjonelle rollen til forskjellige DRG-celler i forskjellige fysiologiske og patologiske forhold.
Selv om vevsryddingsteknikken har blitt brukt til å undersøke 3D-rekonstruksjonen av DRG26 som en alternativ teknikk for kryoseksjonering av DRG, er vevsryddingsteknikken tid- og arbeidskrevende. Til sammenligning er kryoseksjonering av DRG rask og relativt enkel å utføre, og dermed gjenstår det å være en nøkkelteknikk for immunhistokjemi og strukturstudier av DRG og andre regioner i sentralnervesystemet. Imidlertid er det fortsatt en utfordring å oppnå høykvalitets, intakte og flate kryostatseksjoner på glassglass på nevrovitenskapelig forskning på grunn av den lille prøvestørrelsen på vev, som DRG og visse hjernegrupper, og det er ingen artikkel som beskriver den optimale protokollen på dette punktet for kryoseksjonering av små vevsprøver, for eksempel muse-DRG.
Denne protokollen gir en enkel, trinnvis teknikk for kryostatseksjonering av musens DRG for pålitelig å oppnå så mange høykvalitets DRG-seksjoner på lysbildene for påfølgende DRG-studier. Mens den er spesielt utviklet for kryoseksjonering av DRG-prøver, kan denne teknikken potensielt brukes til kryoseksjonering av forskjellige andre vev med liten prøvestørrelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en enkel trinnvis prosedyre for kryostatseksjonering av musens DRG for å oppnå DRG-seksjoner av høy kvalitet på lysbilder pålitelig. Det er fire kritiske trinn i denne protokollen. Først må DRG-prøven og pinsetten være tørr før du legger DRG-prøven på basen OCT. Enhver væske som omgir DRG-prøven vil danne et isskall rundt den, noe som resulterer i DRG-seksjoner som skiller seg fra OCT og bøyer seg. For det andre, hvis aluminiumsblokken ikke har et merke, eller hvis basen OCT dekker m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
Riferimenti
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
