माउस पृष्ठीय रूट गैंग्लियन क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक प्रक्रिया
Summary
यहां प्रस्तुत उच्च गुणवत्ता वाले पृष्ठीय जड़ गैंग्लियन क्रायोस्टैट वर्गों को लगातार प्राप्त करने के लिए विकास है।
Abstract
उच्च गुणवत्ता वाले माउस पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) क्रायोस्टैट अनुभाग भड़काऊ और न्यूरोपैथिक दर्द, खुजली, साथ ही अन्य परिधीय न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के अनुसंधान में उचित इम्यूनोकैमिस्ट्री स्टेनिंग और आरएनएस्कोप अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, डीआरजी ऊतक के छोटे नमूने के आकार के कारण ग्लास स्लाइड पर लगातार उच्च गुणवत्ता वाले, बरकरार और फ्लैट क्रायोस्टेट अनुभाग प्राप्त करना एक चुनौती बनी हुई है। अब तक, डीआरजी क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाला कोई लेख नहीं है। यह प्रोटोकॉल डीआरजी क्रायोसेक्शनिंग से जुड़ी अक्सर आने वाली कठिनाइयों को हल करने के लिए एक चरण-दर-चरण विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तुत लेख बताता है कि डीआरजी ऊतक के नमूनों से आसपास के तरल को कैसे हटाया जाए, डीआरजी वर्गों को एक ही अभिविन्यास के सामने स्लाइड पर रखा जाए, और सुडौल किए बिना ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को समतल किया जाए। यद्यपि यह प्रोटोकॉल डीआरजी नमूनों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इसे एक छोटे नमूने के आकार के साथ कई अन्य ऊतकों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स, ऊतक मैक्रोफेज और उपग्रह कोशिकाएं होती हैं जो प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स 1,2,3,4 को घेरती हैं। यह निर्दोष और हानिकारक संकेतों को संसाधित करने में एक महत्वपूर्ण शारीरिक संरचना है, और दर्द, खुजली, और विभिन्न परिधीय तंत्रिका विकारों 5,6,7,8,9,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यद्यपि माउस रीढ़ की हड्डी14,15,16 से डीआरजी ऊतक को विच्छेदित करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, डीआरजी ऊतक का क्रायोसेक्शनिंग चुनौतीपूर्ण बना हुआ है क्योंकि डीआरजी ऊतक काफी छोटा है, और डीआरजी नमूनों के क्रायोस्टेट अनुभाग रोल में मुड़ते हैं, जिससे क्रायोस्टैट वर्गों को ग्लास स्लाइड पर ठीक से स्थानांतरित करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन और डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स 17,18,19,20,21,22,23 की संरचना के लिए डीआरजी ऊतक का उचित क्रायोसेक्शनिंग महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जैसा कि एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण परिणामों ने मनुष्यों24 और चूहों25 दोनों में डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स की उल्लेखनीय विविधता का खुलासा किया है, विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों में विभिन्न डीआरजी कोशिकाओं की कार्यात्मक भूमिका की जांच के लिए डीआरजी ऊतक का उचित क्रायोसेक्शनिंग महत्वपूर्ण है।
यद्यपि ऊतक-समाशोधन तकनीक को डीआरजी 26 के 3 डी पुनर्निर्माण की जांच के लिए डीआरजी26 के क्रायोसेक्शनिंग की वैकल्पिक तकनीक के रूप में लागू किया गया है, ऊतक-समाशोधन तकनीक समय और श्रम लेने वाली है। इसकी तुलना में, डीआरजी का क्रायोसेक्शनिंग त्वरित और प्रदर्शन करने में अपेक्षाकृत आसान है, और इस प्रकार यह इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और डीआरजी और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों के संरचना अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक बनी हुई है। हालांकि, ग्लास स्लाइड पर उच्च गुणवत्ता वाले, बरकरार और फ्लैट क्रायोस्टैट अनुभाग प्राप्त करना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक चुनौती बनी हुई है, क्योंकि डीआरजी और कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे ऊतकों के छोटे नमूना आकार के कारण, और माउस डीआरजी जैसे छोटे आकार के ऊतक नमूनों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए इस बिंदु पर इष्टतम प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाला कोई लेख नहीं है।
यह प्रोटोकॉल माउस डीआरजी के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग के लिए एक आसान, चरण-दर-चरण तकनीक प्रदान करता है ताकि बाद के डीआरजी अध्ययनों के लिए स्लाइड पर कई उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी अनुभागों को विश्वसनीय रूप से प्राप्त किया जा सके। जबकि विशेष रूप से क्रायोसेक्शनिंग डीआरजी नमूनों के लिए डिज़ाइन किया गया है, इस तकनीक का उपयोग संभावित रूप से एक छोटे नमूने के आकार के साथ विभिन्न अन्य ऊतकों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल विश्वसनीय रूप से स्लाइड पर उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी अनुभागों को प्राप्त करने के लिए माउस डीआरजी के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग के लिए एक आसान चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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