Оценка размера и слияния липидных капель в клетках печени крупного рогатого скота
Summary
В настоящем протоколе описывается, как использовать масляный красный O для окрашивания липидных капель (LD), вычислять размер и количество LD в модели жирных гепатоцитов, индуцированной жирными кислотами, и использовать BODIPY 493/503 для наблюдения за процессом слияния малых LD в большие LD с помощью визуализации живых клеток.
Abstract
Липидные капли (LD) представляют собой органеллы, которые играют важную роль в липидном обмене и хранении нейтральных липидов в клетках. Они связаны с различными метаболическими заболеваниями, такими как ожирение, жировая болезнь печени и диабет. В клетках печени размеры и количество LD являются признаками жировой болезни печени. Более того, реакция окислительного стресса, клеточная аутофагия и апоптоз часто сопровождаются изменениями размеров и количества LD. В результате, размеры и количество ЛД являются основой современных исследований механизма биогенеза ЛД. Здесь, в клетках печени крупного рогатого скота, индуцированных жирными кислотами, мы описываем, как использовать масляный красный O для окрашивания LD и для исследования размеров и количества LD. Статистически проанализировано распределение LD по размерам. Процесс слияния малых LD в большие LD также наблюдается с помощью системы визуализации живых клеток. Текущая работа дает возможность непосредственно наблюдать тенденцию изменения размера LD в различных физиологических условиях.
Introduction
Накопление липидных капель (ЛД) в гепатоцитах является типичной характеристикой неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая может прогрессировать до фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Установлено, что самым ранним проявлением жировой болезни печени является стеатоз, характеризующийся накоплением ЛД в цитоплазме гепатоцита1. Стеатоз печени неизменно связан с увеличением количества и/или увеличением размераLDs2. Считается, что LD генерируются эндоплазматическим ретикулумом (ER), состоящим из триглицеридов (TG) в качестве ядра, и окружены белками и фосфолипидами3. Как субклеточная органелла, ответственная за хранение ТГ, LD проявляют различные особенности в отношении их размера, количества, липидного состава, белков и взаимодействия с другими органеллами, все из которых влияют на энергетический гомеостазклетки 4. Уровень ТГ положительно коррелирует с размером ЛД, и более высокое внутриклеточное содержание ТГ может образовывать более крупные ЛД5. ЛД увеличиваются в размерах за счет локального синтеза ТГ, включения липидов в ЭР и слияния нескольких ЛД6. Клетки (адипоциты, гепатоциты и т. д.), содержащие большие ЛД, имеют специальный механизм для эффективного увеличения накопления липидов путем слияния ЛД. Динамические изменения LD отражают различные состояния энергетического метаболизма клетки. Крайне важно разработать методологии, которые позволяют наблюдать и анализировать различные печеночные LD в здоровых и аномальных клетках.
Основными нефлуоресцентными красителями для LD являются суданский черный B и масляный красный O. Sudan Black B окрашивает нейтральные липиды, фосфолипиды и стероиды7. Масляный красный O в основном используется для окрашивания LD скелетных мышц, кардиомиоцитов, ткани печени, жировых клеток и т.Д. 8., и считается стандартным инструментом для количественного выявления стеатоза печени у мышей и людей9. Динамическое изменение LD в основном осуществляется флуоресцентным окрашиванием. Нильский красный и BODIPY являются широко используемыми флуоресцентными липидными красителями10,11. По сравнению с нильским красным, BODIPY обладает более сильной проницаемостью для тканей и лучше связывается с LDs12. LD, меченные BODIPY, могут быть использованы для окрашивания живых клеток и колокализации с другими органеллами13.
Заболеваемость жировой болезнью печени значительно выше у жвачных животных, чем у животных с моногастричными желудками14. В переходный период у дойных коров наблюдается состояние отрицательного энергетическогобаланса3. Большое количество неэтерифицированных жирных кислот (пальмитиновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота и др.) синтезируется в ТГ в гепатоцитах крупного рогатого скота, что приводит к функциональной патологии печени и значительно снижает качество молочных продуктов и эффективность производства15. Настоящее исследование направлено на предоставление протокола для анализа размера и количества LD, а также для мониторинга динамики слияния LD. Мы построили модель образования LD путем добавления различных концентраций линолевой кислоты (LA) в гепатоцитах16 и наблюдали изменения размера и количества LD в процессе, окрашивая LD масляным красным O. Кроме того, процесс быстрого слияния LDs также наблюдался при окрашивании BODIPY 493/503.
Protocol
Representative Results
Discussion
В зависимости от патологических состояний печеночные ЛД претерпевают колоссальные изменения в своих размерах и количестве. ЛД широко присутствуют в клетках гепатоцитов и играют ключевую роль в здоровье и заболеваниях печени18. Количество и размер ЛД лежат в основе соврем?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано совместно Национальным фондом естественных наук Китая (U1904116).
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
Riferimenti
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O’Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, &. #. 2. 0. 1. ;. Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
