Summary

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

تم وصف إجراء لدراسة ديناميكيات استقلاب الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا باستخدام تنسيق لوحة متعددة الآبار والتصوير المناعي الآلي للكشف عن تخليق وتوزيع mtDNA وتحديده. يمكن استخدام هذا أيضا للتحقيق في آثار مثبطات مختلفة ، والضغوط الخلوية ، وإسكات الجينات على استقلاب mtDNA.

Abstract

تتطلب الغالبية العظمى من العمليات الخلوية إمدادا مستمرا بالطاقة ، والناقل الأكثر شيوعا هو جزيء ATP. تنتج الخلايا الحقيقية النواة معظم جزيئات ATP في الميتوكوندريا عن طريق الفسفرة التأكسدية. الميتوكوندريا عضيات فريدة من نوعها لأن لها جينوم خاص بها يتضاعف وينتقل إلى الجيل التالي من الخلايا. على عكس الجينوم النووي ، هناك نسخ متعددة من جينوم الميتوكوندريا في الخلية. تعد الدراسة التفصيلية للآليات المسؤولة عن تكرار وإصلاح وصيانة جينوم الميتوكوندريا ضرورية لفهم الأداء السليم للميتوكوندريا والخلايا بأكملها في ظل الظروف العادية والمرضية. هنا ، يتم تقديم طريقة تسمح بالقياس الكمي عالي الإنتاجية لتوليف وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا البشرية المزروعة في المختبر . يعتمد هذا النهج على الكشف المناعي لجزيئات الحمض النووي المركبة بنشاط والتي تم تصنيفها بواسطة دمج 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) والكشف المتزامن عن جميع جزيئات mtDNA مع الأجسام المضادة للحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور الميتوكوندريا بأصباغ أو أجسام مضادة محددة. إن زراعة الخلايا في شكل متعدد الآبار واستخدام مجهر مضان آلي يجعل من السهل دراسة ديناميكيات mtDNA ومورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية في وقت قصير نسبيا.

Introduction

بالنسبة لمعظم الخلايا حقيقية النواة، تعتبر الميتوكوندريا عضيات أساسية؛ لأنها تلعب دورا مهما في العديد من العمليات الخلوية. أولا وقبل كل شيء ، الميتوكوندريا هي موردي الطاقة الرئيسيين للخلايا1. تشارك الميتوكوندريا أيضا في تنظيم التوازن الخلوي (على سبيل المثال ، الأكسدة والاختزال داخل الخلايا2 وتوازن الكالسيوم3) ، وإشارات الخلية4,5 ، وموت الخلايا المبرمج6 ، وتوليف المركبات الكيميائية الحيوية المختلفة 7,8 ، والاستجابة المناعية الفطرية9. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بحالات مرضية مختلفة وأمراض بشرية10.

يعتمد عمل الميتوكوندريا على المعلومات الوراثية الموجودة في جينومين منفصلين: الجينوم النووي والميتوكوندريا. يشفر جينوم الميتوكوندريا عددا صغيرا من الجينات مقارنة بالجينوم النووي ، لكن جميع الجينات المشفرة بالحمض النووي mtDNA ضرورية لحياة الإنسان. يتم ترميز آلية بروتين الميتوكوندريا اللازمة للحفاظ على mtDNA بواسطة nDNA. تم بالفعل تحديد المكونات الأساسية لرد الميتوكوندريا ، وكذلك بعض عوامل التكوين الحيوي للميتوكوندريا (تمت مراجعتها في البحث السابق11،12). ومع ذلك ، لا تزال آليات تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا وصيانتها بعيدة عن الفهم. على عكس nDNA ، يوجد جينوم الميتوكوندريا في نسخ متعددة ، مما يوفر طبقة إضافية لتنظيم التعبير الجيني للميتوكوندريا. لا يعرف الكثير حاليا عن توزيع وفصل mtDNA داخل العضيات ، إلى أي مدى يتم تنظيم هذه العمليات ، وإذا كانت كذلك ، فما هي البروتينات المشاركة13. يعد نمط الفصل أمرا بالغ الأهمية عندما تحتوي الخلايا على مجموعة مختلطة من الحمض النووي mtDNA من النوع البري والمتحول. قد يؤدي توزيعها غير المتكافئ إلى توليد خلايا تحتوي على كمية ضارة من mtDNA المتحور.

حتى الآن ، تم تحديد عوامل البروتين اللازمة لصيانة mtDNA بشكل أساسي عن طريق الطرق الكيميائية الحيوية أو التحليلات المعلوماتية الحيوية أو من خلال الدراسات المرتبطة بالمرض. في هذا العمل ، من أجل ضمان فرصة كبيرة لتحديد العوامل التي نجت من تحديد الهوية سابقا ، يتم وصف استراتيجية مختلفة. تعتمد الطريقة على وضع العلامات على mtDNA أثناء النسخ المتماثل أو الإصلاح باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) ، وهو نظير نيوكليوزيد للثيميدين. يتم دمج BrdU بسهولة في خيوط الحمض النووي الوليدة أثناء تخليق الحمض النووي ، وبشكل عام ، يستخدم لمراقبة تكرار الحمض النوويالنووي 14. ومع ذلك ، فقد تم تحسين الإجراء الذي تم تطويره هنا للكشف عن BrdU المدمج في mtDNA باستخدام التألق المناعي للأجسام المضادة ل BrdU.

يسمح هذا النهج بالقياس الكمي عالي الإنتاجية لتخليق mtDNA وتوزيعه في الخلايا البشرية المزروعة في المختبر. من الضروري وجود استراتيجية عالية الإنتاجية لإجراء الاختبارات في ظل ظروف تجريبية مختلفة في وقت قصير نسبيا ؛ لذلك ، يقترح في البروتوكول استخدام تنسيق متعدد الآبار لزراعة الخلايا والمجهر الفلوري الآلي للتصوير. يتضمن البروتوكول نقل خلايا هيلا البشرية مع مكتبة siRNA والمراقبة اللاحقة لتكرار mtDNA أو إصلاحه باستخدام وضع العلامات الأيضية للحمض النووي المركب حديثا مع BrdU. يتم الجمع بين هذا النهج مع التلوين المناعي للحمض النووي بمساعدة الأجسام المضادة للحمض النووي. يتم تحليل كلتا المعلمتين باستخدام المجهر الفلوري الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور الميتوكوندريا بصبغة معينة. لإثبات خصوصية البروتوكول ، تم اختبار تلطيخ BrdU على خلايا خالية من mtDNA (خلايا rho0) ، وعلى خلايا HeLa عند إسكات عوامل صيانة mtDNA المعروفة ، وعلى خلايا HeLa بعد العلاج بمثبط تكرار mtDNA. تم قياس مستويات mtDNA أيضا بطريقة مستقلة ، وهي qPCR.

Protocol

1. تحضير خليط siRNA قبل يوم واحد من بدء التجربة ، خلايا البذور (على سبيل المثال ، HeLa) على طبق 100 مم بحيث تصل إلى التقاء 70٪ -90٪ في اليوم التالي.ملاحظة: يجب إجراء جميع العمليات في ظل ظروف معقمة في غرفة التدفق الصفحي. تحضير الكمية المناسبة من siRNA المخفف إلى تركيز 140 نانومتر في وس?…

Representative Results

يظهر مخطط لإجراء الدراسة عالية الإنتاجية لديناميكيات تخليق وتوزيع mtDNA في الشكل 1. يتيح استخدام تنسيق لوحة متعددة الآبار التحليل المتزامن للعديد من الظروف التجريبية المختلفة ، مثل إسكات الجينات المختلفة باستخدام مكتبة siRNA. تسمح الظروف المستخدمة لوضع العلامات على جزيئات ال…

Discussion

تاريخيا ، تم استخدام وضع علامات الحمض النووي عن طريق دمج BrdU والكشف عن الأجسام المضادة في تكرار الحمض النووي النووي وأبحاث دورة الخلية14،27،28. حتى الآن ، تضمنت جميع بروتوكولات الكشف عن الحمض النووي المسمى BrdU خطوة تمسخ الحمض النووي (حمضي أو ح…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا (رقم المنحة / الجائزة: 2018/31 / D / NZ2 / 03901).

Materials

2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) Sigma-Aldrich D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black Greiner Bio-One #781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Sigma-Aldrich B5002-1G Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film Nerbe Plus 04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21426
BioTek 405 LS microplate washer Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Cell counting chamber Thoma Heinz Herenz REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cytiva SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635 Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody Progen #61014
LightCycler 480 System Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific #13778150
MitoTracker Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 Mitochondria tracking dye 
Multidrop Combi Reagent Dispenser Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
qPCR primer Fw B2M (reference) CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR primer Fw GPI (reference gene) GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1  TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR primer Fw POLG TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference) GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR primer Rev GPI (reference gene) AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1  ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR primer Rev POLG GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope Olympus
siRNA Ctrl Dharmacon D-001810-10-5
siRNA POLG Invitrogen POLGHSS108223
siRNA TFAM Invitrogen TFAMHSS144252
siRNA TWNK Invitrogen C10orf2HSS125597
Suction device NeoLab 2-9335 Suction device for cell culture
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Trypsin Biowest L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective Olympus

Riferimenti

  1. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
  2. Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
  3. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
  6. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  7. Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
  8. Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
  9. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  10. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  11. Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
  12. Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
  13. Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
  14. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  15. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
  17. . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
  18. . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
  19. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
  20. . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
  21. Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
  22. Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
  23. Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
  24. Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
  25. Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
  26. Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
  27. Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
  28. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
  29. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
  30. Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).

Play Video

Citazione di questo articolo
Borowski, L. S., Kasztelan, K., Czerwinska-Kostrzewska, J., Szczesny, R. J. High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution. J. Vis. Exp. (195), e65236, doi:10.3791/65236 (2023).

View Video