Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung
Summary
Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Dynamik des mitochondrialen DNA-Stoffwechsels (mtDNA) in Zellen unter Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats und automatisierter Immunfluoreszenzbildgebung zum Nachweis und zur Quantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung beschrieben. Dies kann weiter genutzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Belastungen und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen.
Abstract
Die überwiegende Mehrheit der zellulären Prozesse erfordert eine kontinuierliche Energiezufuhr, deren häufigster Träger das ATP-Molekül ist. Eukaryotische Zellen produzieren den größten Teil ihres ATP in den Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung. Mitochondrien sind einzigartige Organellen, weil sie ein eigenes Genom haben, das repliziert und an die nächste Generation von Zellen weitergegeben wird. Im Gegensatz zum Kerngenom gibt es in der Zelle mehrere Kopien des mitochondrialen Genoms. Die detaillierte Untersuchung der Mechanismen, die für die Replikation, Reparatur und Aufrechterhaltung des mitochondrialen Genoms verantwortlich sind, ist unerlässlich, um das ordnungsgemäße Funktionieren von Mitochondrien und ganzen Zellen sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu verstehen. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Hochdurchsatzquantifizierung der Synthese und Verteilung von mitochondrialer DNA (mtDNA) in in vitro kultivierten humanen Zellen ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf der Immunfluoreszenzdetektion von aktiv synthetisierten DNA-Molekülen, die durch den Einbau von 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) markiert sind, und der gleichzeitigen Detektion aller mtDNA-Moleküle mit Anti-DNA-Antikörpern. Zusätzlich werden die Mitochondrien mit spezifischen Farbstoffen oder Antikörpern sichtbar gemacht. Die Kultivierung von Zellen im Multi-Well-Format und der Einsatz eines automatisierten Fluoreszenzmikroskops erleichtern es, die Dynamik der mtDNA und die Morphologie der Mitochondrien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen in relativ kurzer Zeit zu untersuchen.
Introduction
Für die meisten eukaryotischen Zellen sind Mitochondrien essentielle Organellen, da sie eine entscheidende Rolle in zahlreichen zellulären Prozessen spielen. Mitochondrien sind in erster Linie die wichtigsten Energielieferanten der Zellen1. Mitochondrien sind auch an der Regulierung der zellulären Homöostase (z. B. intrazelluläres Redox2 und des Kalziumhaushalts3), der Zellsignalübertragung 4,5, der Apoptose6, der Synthese verschiedener biochemischer Verbindungen 7,8 und der angeborenen Immunantwortbeteiligt 9. Mitochondriale Dysfunktion wird mit verschiedenen pathologischen Zuständen und menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht10.
Die Funktion der Mitochondrien hängt von der genetischen Information ab, die sich in zwei getrennten Genomen befindet: dem Kern- und dem mitochondrialen Genom. Das mitochondriale Genom kodiert im Vergleich zum Kerngenom nur eine kleine Anzahl von Genen, aber alle mtDNA-kodierten Gene sind für das menschliche Leben unerlässlich. Die mitochondriale Proteinmaschinerie, die für die Aufrechterhaltung der mtDNA notwendig ist, wird von nDNA kodiert. Die grundlegenden Komponenten des mitochondrialen Replisoms sowie einige mitochondriale Biogenesefaktoren wurden bereits identifiziert (in früheren Forschungsarbeiten überprüft11,12). Die mitochondrialen DNA-Replikations- und Erhaltungsmechanismen sind jedoch noch weit davon entfernt, verstanden zu werden. Im Gegensatz zur nDNA liegt das mitochondriale Genom in mehreren Kopien vor, was eine zusätzliche Schicht zur Regulierung der mitochondrialen Genexpression darstellt. Viel weniger ist derzeit über die Verteilung und Segregation von mtDNA innerhalb von Organellen bekannt, inwieweit diese Prozesse reguliert sind und wenn ja, welche Proteine beteiligt sind13. Das Segregationsmuster ist entscheidend, wenn Zellen eine gemischte Population aus Wildtyp- und mutierter mtDNA enthalten. Ihre ungleiche Verteilung kann zur Bildung von Zellen mit einer schädlichen Menge an mutierter mtDNA führen.
Bisher wurden die Proteinfaktoren, die für den Erhalt der mtDNA notwendig sind, vor allem durch biochemische Methoden, bioinformatische Analysen oder durch krankheitsassoziierte Studien identifiziert. Um eine hohe Wahrscheinlichkeit zu gewährleisten, Faktoren zu identifizieren, die sich bisher der Identifizierung entzogen haben, wird in dieser Arbeit eine andere Strategie beschrieben. Die Methode basiert auf der Markierung von mtDNA während der Replikation oder Reparatur mit 5-Brom-2′-desoxyuridin (BrdU), einem Nukleosid-Analogon von Thymidin. BrdU wird während der DNA-Synthese leicht in entstehende DNA-Stränge eingebaut und im Allgemeinen zur Überwachung der Replikation von Kern-DNAverwendet 14. Das hier entwickelte Verfahren wurde jedoch für den Nachweis von in mtDNA eingebautem BrdU unter Verwendung der Immunfluoreszenz von Anti-BrdU-Antikörpern optimiert.
Der Ansatz ermöglicht die Hochdurchsatzquantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung in humanen Zellen, die in vitro kultiviert wurden. Eine Hochdurchsatzstrategie ist notwendig, um Tests unter verschiedenen Versuchsbedingungen in relativ kurzer Zeit durchzuführen; Daher wird im Protokoll vorgeschlagen, ein Multi-Well-Format für die Zellkultivierung und automatisierte Fluoreszenzmikroskopie für die Bildgebung zu verwenden. Das Protokoll umfasst die Transfektion von humanen HeLa-Zellen mit einer siRNA-Bibliothek und die anschließende Überwachung der mtDNA-Replikation oder -Reparatur durch die metabolische Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU. Dieser Ansatz wird mit einer Immunfärbung der DNA mit Hilfe von Anti-DNA-Antikörpern kombiniert. Beide Parameter werden mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Zusätzlich werden Mitochondrien mit einem bestimmten Farbstoff sichtbar gemacht. Um die Spezifität des Protokolls zu demonstrieren, wurde die BrdU-Färbung an Zellen ohne mtDNA (rho0-Zellen), an HeLa-Zellen nach dem Silencing bekannter mtDNA-Erhaltungsfaktoren und an HeLa-Zellen nach Behandlung mit einem mtDNA-Replikationsinhibitor getestet. Die mtDNA-Konzentrationen wurden auch mit einer unabhängigen Methode, nämlich der qPCR, gemessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Vergangenheit wurde die DNA-Markierung durch BrdU-Einbau und Antikörpernachweis in der nukleären DNA-Replikation und Zellzyklusforschung eingesetzt 14,27,28. Bisher enthielten alle Protokolle zum Nachweis von BrdU-markierter DNA einen DNA-Denaturierungsschritt (sauer oder thermisch) oder einen Enzymverdau (DNase oder Proteinase), um die Epitopexposition zu ermöglichen und das Eindringen von Antikörpern zu erleichtern….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Science Centre, Polen unterstützt (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
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