Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen
Summary
We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.
Abstract
Van geleedpotigen is bekend dat ze een verscheidenheid aan virussen van medisch en agrarisch belang overbrengen via hun hemolymfe, wat essentieel is voor virusoverdracht. Hemolymfeverzameling is de basistechnologie voor het bestuderen van virus-vectorinteracties. Hier beschrijven we een nieuwe en eenvoudige methode voor de kwantitatieve verzameling van hemolymfe van kleine geleedpotigen met behulp van Laodelphax striatellus (de kleine bruine planthopper, SBPH) als een onderzoeksmodel, omdat deze geleedpotige de belangrijkste vector is van het rijststreepvirus (RSV). In dit protocol begint het proces door voorzichtig een been van de bevroren geleedpotige af te knijpen met een pincet met een fijne punt en de hemolymfe uit de wond te drukken. Vervolgens wordt een eenvoudige micropipette bestaande uit een capillair en een pipetbol gebruikt om de transudatieve hemolymfe uit de wond te verzamelen volgens het principe van capillaire krachten. Ten slotte kan de verzamelde hemolymfe worden opgelost in een specifieke buffer voor verder onderzoek. Deze nieuwe methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen is een nuttig en efficiënt hulpmiddel voor verder onderzoek naar arbovirussen en vector-virus interacties.
Introduction
Zowel dierlijke als plantaardige virussen kunnen worden overgedragen door geleedpotigen, en deze virussen vormen een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid en veroorzaken enorme economische verliezen in de landbouw 1,2,3. Belangrijk is dat de geleedpotige hemolymfe, die dient als de bloedsomloop en een vitaal element van het immuunsysteem in geleedpotigen, een belangrijke rol speelt bij het reguleren van arbovirale transmissie. Virussen verkregen via de geleedpotige darmen worden pas naar andere weefsels getransporteerd nadat ze met succes zijn ontsnapt aan de ongunstige hemolymfeomgeving 4,5,6,7. De levenscyclus van virussen in de geleedpotige hemolymfe omvat virusoverleving in het vloeibare plasma, binnenkomst in de hemocyt en transport naar andere weefsels, en verschillende virus-vectorinteractiemechanismen treden op in de hemolymfe 8,9,10,11,12. De verticale transmissie van RSV door de SBPH is bijvoorbeeld afhankelijk van een moleculaire interactie tussen het SBPH-vitellogenine-eiwit en het RSV-capside-eiwit (rijststreepvirus)13,14. Sommige virussen kunnen ontsnappen aan de immuunrespons van de hemolymfe door specifieke vectorfactoren te binden15,16,17,18. Daarom is het onderzoeken van vector-virusinteracties in de hemolymfe van geleedpotigen belangrijk voor het ontwikkelen van een beter begrip van arbovirusoverdracht.
De hemolymfe van sommige kleine insecten, zoals planthoppers, leafhoppers en sommige muggen, is moeilijk te verzamelen vanwege hun grootte. Om dit probleem aan te pakken, zijn verschillende methoden ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen, waaronder het rechtstreeks inbrengen van een spuitnaald in het insectenlichaam om een microvolume van de hemolymfe te extraheren, het verzamelen van exsudaat van de wondplaats met een pincet met een fijne punt en directe centrifugatie. Deze methoden hebben het mogelijk gemaakt om relatieve genexpressieniveaus en virale titers binnen de hemolymfe 19,20,21 te meten. Een effectieve methode voor het kwantificeren van het hemolymfevolume, die nodig is voor het tellen van hemocyten, eiwitkwantificering en enzymactiviteitsanalyse, is momenteel echter niet beschikbaar voor deze kleine insecten.
De SBPH (kleine bruine planthopper) is een soort kleine insectenvector met een lichaamslengte van ongeveer 2-4 mm. De SBPH is in staat om een verscheidenheid aan plantenvirussen over te brengen, waaronder RSV, maïs ruw dwergvirus en rijstzwart gestreept dwergvirus22,23,24. De interactie tussen de SBPH en RSV is het afgelopen decennium diepgaand bestudeerd. Om het werken met SBPHs te vergemakkelijken, hebben we een nieuwe en eenvoudige methode ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen. Deze methode, die is gebaseerd op het principe van capillaire krachten, maakt gebruik van een capillair met een schaalmarkering om de hemolymfe van het insect op een nauwkeurige en kwantificeerbare manier te verkrijgen. Dit stelt ons in staat om een specifiek volume hemolymfe van kleine insecten efficiënt te verzamelen en de hemolymfe-omgeving van kleine vectoren in meer detail te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemolymfe is het medium van de bloedsomloop in geleedpotigen en arbovirussen kunnen alleen andere geleedpotige weefsels binnendringen als ze de vijandige hemolymfe-omgeving kunnen overleven. Het verzamelen van een hoogwaardig monster van hemolymfe is de eerste stap in het bestuderen van de vector-virusinteracties die optreden in de hemolymfe. Er is gemeld dat hemolymfe van insecten kan worden verkregen op verschillende plaatsen op het lichaam van het insect, waaronder een wond op het voorbeen, een kleine incisie in het h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Key R&D Program of China (nr. 2022YFD1401700) en door de National Science Foundation of China (nr. 32090013 en nr. 32072385).
Materials
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
Riferimenti
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
