Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Summary

Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l’emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Abstract

Gli artropodi sono noti per trasmettere una varietà di virus di importanza medica e agricola attraverso la loro emolinfa, che è essenziale per la trasmissione del virus. La raccolta dell’emolinfa è la tecnologia di base per lo studio delle interazioni virus-vettore. Qui, descriviamo un nuovo e semplice metodo per la raccolta quantitativa di emolinfa da piccoli artropodi usando Laodelphax striatellus (la piccola cavalletta bruna, SBPH) come modello di ricerca, poiché questo artropode è il principale vettore del virus della striscia di riso (RSV). In questo protocollo, il processo inizia pizzicando delicatamente una gamba dell’artropode congelato con una pinzetta a punta fine e premendo l’emolinfa fuori dalla ferita. Quindi, una semplice micropipetta composta da un capillare e un bulbo di pipetta viene utilizzata per raccogliere l’emolinfa trasudativa dalla ferita secondo il principio delle forze capillari. Infine, l’emolinfa raccolta può essere sciolta in un tampone specifico per ulteriori studi. Questo nuovo metodo per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi è uno strumento utile ed efficiente per ulteriori ricerche sugli arbovirus e sulle interazioni vettore-virus.

Introduction

Sia i virus animali che quelli vegetali possono essere trasmessi dagli artropodi e questi virus rappresentano una grave minaccia per la salute umana e causano enormi perdite economiche in agricoltura ^1,2,3. È importante sottolineare che l’emolinfa degli artropodi, che funge da sistema circolatorio e un elemento vitale del sistema immunitario negli artropodi, svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione arbovirale. I virus acquisiti attraverso l’intestino degli artropodi vengono trasportati ad altri tessuti solo dopo essere sfuggiti con successo all’ambiente emolinfatico avverso 4,5,6,7. Il ciclo di vita dei virus nell’emolinfa degli artropodi comporta la sopravvivenza del virus nel plasma fluido, l’ingresso nell’emocita e il trasporto ad altri tessuti, e vari meccanismi di interazione virus-vettore si verificano nell’emolinfa 8,9,10,11,12. Ad esempio, la trasmissione verticale di RSV da parte dell’SBPH dipende da un’interazione molecolare tra la proteina vitellogenina SBPH e la proteina del capside RSV (virus della striscia di riso)^13,14. Alcuni virus possono sfuggire alla risposta immunitaria dell’emolinfa legando specifici fattori vettoriali^15,16,17,18. Pertanto, lo studio delle interazioni vettore-virus nell’emolinfa degli artropodi è importante per sviluppare una migliore comprensione della trasmissione dell’arbovirus.

L’emolinfa di alcuni piccoli insetti, come cavallette, cicaline e alcune zanzare, è difficile da raccogliere a causa delle loro dimensioni. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati diversi metodi per raccogliere l’emolinfa, tra cui l’inserimento di un ago da siringa direttamente nel corpo dell’insetto per estrarre un microvolume dell’emolinfa, la raccolta dell’essudato dal sito della ferita con pinzette a punta fine e la centrifugazione diretta. Questi metodi hanno permesso la misurazione dei livelli relativi di espressione genica e dei titoli virali all’interno dell’emolinfa 19,20,21. Tuttavia, un metodo efficace per quantificare il volume dell’emolinfa, necessario per il conteggio degli emociti, la quantificazione delle proteine e l’analisi dell’attività enzimatica, non è attualmente disponibile per questi piccoli insetti.

Il SBPH (piccola cavalletta marrone) è un tipo di piccolo insetto vettore con una lunghezza del corpo di circa 2-4 mm. L’SBPH è in grado di trasmettere una varietà di virus vegetali, tra cui RSV, virus nano grezzo del mais e virus nano striato nero del riso^22,23,24. L’interazione tra SBPH e RSV è stata studiata in modo approfondito negli ultimi dieci anni. Per facilitare il lavoro con gli SBPH, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice per raccogliere l’emolinfa. Questo metodo, che si basa sul principio delle forze capillari, utilizza un capillare con un segno di scala per acquisire l’emolinfa dell’insetto in modo preciso e quantificabile. Questo ci permette di raccogliere un volume specifico di emolinfa da piccoli insetti in modo efficiente e di studiare l’ambiente emolinfatico di piccoli vettori in modo più dettagliato.

Protocol

1. Allevamento di insetti Aumentare le SBPH utilizzate in questo esperimento nelle piantine di riso (Oryza sativa cv. Nipponbare). Piantare 20 piantine di riso in un’incubatrice (65 mm x 200 mm) e crescere a 25 °C sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. 2. Dissezione degli SBPH per la raccolta dell’emolinfa Mettere gli SBPH in una provetta da centrifuga e metterli in un bagno di ghiaccio per 10-30 minuti….

Representative Results

Modello di micropipetta e raccolta dell’emolinfaAbbiamo sviluppato una semplice micropipetta la cui azione si basa sulle forze capillari del tubo capillare. La micropipetta è composta da un tubo capillare e da un bulbo per pipetta (Figura 1A). I tubi capillari sono disponibili in diverse dimensioni di volume che vanno da 1 μL a 20 μL e i volumi dei tubi capillari sono selezionati in base alle esigenze. I tubi capillari con volumi più piccoli non sono suggeriti perch?…

Discussion

L’emolinfa è il mezzo del sistema circolatorio negli artropodi e gli arbovirus possono invadere altri tessuti degli artropodi solo se sono in grado di sopravvivere all’ambiente emolinfatico ostile. La raccolta di un campione di alta qualità di emolinfa è il primo passo nello studio delle interazioni vettore-virus che si verificano nell’emolinfa. È stato riportato che l’emolinfa degli insetti può essere ottenuta da diversi siti sul corpo dell’insetto, tra cui una ferita sulla gamba anteriore, un’incisione minore nell…

Materials

10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation