小型節足動物から血リンパを採取するための正確で定量可能な方法
Summary
我々は、その後の解析のために、小型節足動物から定量可能な血リンパを効率的に採取する方法について述べる。
Abstract
節足動物は、ウイルス感染に不可欠な血リンパを介して、医学的および農業的に重要なさまざまなウイルスを感染させることが知られています。血リンパ採取は、ウイルスとベクターの相互作用を研究するための基盤技術です。本稿では,イネストライプウイルス(RSV)の主ベクターである Laodelphax striatellus (小型トビイロウンカ,SBPH)を研究モデルとして,小型節足動物から血リンパを定量的に採取する新規かつ簡便な方法について述べる.このプロトコルでは、このプロセスは、凍った節足動物の片方の足を細いピンセットでそっとつまみ、血リンパを傷口から押し出すことから始まります。次に、毛細血管とピペットバルブからなる単純なマイクロピペットを使用して、毛細管力の原理に従って創傷から浸出性血リンパを収集します。最後に、採取した血リンパは、さらなる研究のために特定の緩衝液に溶解することができる。小型節足動物から血リンパを採取するこの新しい方法は、アルボウイルスとベクター-ウイルス相互作用のさらなる研究のための有用で効率的なツールです。
Introduction
動物ウイルスと植物ウイルスの両方が節足動物によって伝染する可能性があり、これらのウイルスは人間の健康に深刻な脅威をもたらし、農業に多大な経済的損失をもたらします1,2,3。重要なことに、節足動物の循環系および免疫系の重要な要素として機能する節足動物の血リンパは、アルボウイルス感染の調節に重要な役割を果たしています。節足動物の腸を介して獲得されたウイルスは、有害な血リンパ環境から首尾よく脱出した後にのみ他の組織に輸送されます4,5,6,7。節足動物血リンパにおけるウイルスのライフサイクルは、流体血漿中のウイルスの生存、血球への侵入、および他の組織への輸送を含み、血リンパでは様々なウイルス-ベクター相互作用メカニズムが起こります8,9,10,11,12。例えば、SBPHによるRSVの垂直伝達は、SBPHビテロゲニンタンパク質とRSV(イネストライプウイルス)キャプシドタンパク質との間の分子相互作用に依存する13、14。一部のウイルスは、特定のベクター因子15、16、17、18に結合することにより、血リンパの免疫応答を逃れる可能性があります。したがって、節足動物の血リンパにおけるベクターとウイルスの相互作用を調べることは、アルボウイルス伝播の理解を深めるために重要です。
ウンカ、ヨコバイ、一部の蚊などの一部の小さな昆虫の血リンパは、そのサイズのために収集が困難です。この問題に対処するために、昆虫の体内に注射針を直接挿入して微量の血リンパを抽出する方法、先端の細いピンセットで創傷部位から滲出液を採取する方法、直接遠心分離する方法などが開発されています。これらの方法により、血リンパ内の相対的な遺伝子発現レベルとウイルス力価の測定が可能になりました19、20、21。しかし、これらの小型昆虫に対しては、血球計数、タンパク質定量、酵素活性解析に必要な血リンパ量の定量に有効な方法は現在のところありません。
SBPH(小さな茶色のウンカ)は、体長が約2〜4 mmの小さな昆虫ベクターの一種です。SBPHは、RSV、トウモロコシラフドワーフウイルス、イネブラックストリークドワーフウイルスなど、さまざまな植物ウイルスを感染させることができます22、23、24。SBPHとRSVの相互作用は、過去10年間にわたって詳細に研究されてきました。SBPHの取り扱いを容易にするために、血リンパを採取する斬新で簡単な方法を開発しました。毛細管力の原理に基づくこの方法は、目盛りの付いた毛細血管を使用して、昆虫の血リンパを正確かつ定量化可能な方法で取得します。これにより、小型昆虫から特定量の血リンパを効率的に採取し、小型ベクターの血リンパ環境をより詳細に調べることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
血リンパは節足動物の循環系の媒体であり、アルボウイルスは敵対的な血リンパ環境を生き残ることができる場合にのみ他の節足動物組織に侵入することができます。血リンパの高品質のサンプルを収集することは、血リンパで発生するベクターとウイルスの相互作用を研究するための最初のステップです。昆虫の血リンパは、前脚の傷、頭部の小さな切開、腹部の裂傷など、昆虫の体のい?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(No.2022YFD1401700)および中国国家科学財団(No.32090013およびNo.32072385)によってサポートされました。
Materials
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
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