हम उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक दो-चरण यी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रोटीन की खोज और प्रोटिओम पैमाने पर परिमाणीकरण के साथ संगत है। हमारे प्रोटोकॉल को आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता नहीं है और इस प्रकार किसी भी प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।
अधिकांश शारीरिक और रोग प्रक्रियाएं, केंद्रीय चयापचय से लेकर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से लेकर न्यूरोडीजेनेरेशन तक, माइटोकॉन्ड्रिया को शामिल करती हैं। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम 1,000 से अधिक प्रोटीन से बना है, और प्रत्येक की बहुतायत बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में या रोग की प्रगति के दौरान गतिशील रूप से भिन्न हो सकती है। यहां, हम प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। दो-चरणीय प्रक्रिया में (1) कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए यांत्रिक समरूपीकरण और अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन शामिल हैं, और (2) शुद्ध ऑर्गेनेल को अलग करने और दूषित पदार्थों को खत्म करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का टैग-मुक्त प्रतिरक्षा कैप्चर शामिल है। प्रत्येक शुद्धि चरण से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जाता है, और संवर्धन पैदावार की गणना की जाती है, जिससे घटाव प्रोटिओमिक्स द्वारा नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज की अनुमति मिलती है। हमारा प्रोटोकॉल सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील और व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
माइटोकॉन्ड्रिया जटिल और गतिशील अंग हैं जो कोशिका की चयापचय आवश्यकताओं को समझने और अनुकूलित करने में सक्षम हैं। सेलुलर चयापचय की जटिलता के केंद्रीय, माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय हब के रूप में कार्य करते हैं जहां कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और सह-कारक चयापचय प्रतिक्रियाएं अभिसरणकरती हैं। वे जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मार्गों के लिए और आयनों और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 2,3 में परिवर्तन के जवाब में सिग्नलिंग ऑर्गेनेल के रूप में भी काम करते हैं। आज तक, लगभग 1,100 प्रोटीन ों को माइटोकॉन्ड्रिया 4,5,6 में मैप किया गया है, फिर भी हम मान सकते हैं कि कई और खोजे जाने बाकी हैं, विशेष रूप से वे जो केवल कुछ सेल प्रकारों में या विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों में क्षणिक रूप से व्यक्त किए जाते हैं। रुचि के चयापचय राज्यों में माइटोकॉन्ड्रियल संरचना में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने से इन ऑर्गेनेल के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि होगी और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन7 की विशेषता वाले विकारों के लिए नए चिकित्सीय रास्ते उजागर होंगे।
वर्तमान में, विभिन्न माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, अलग-अलग पैदावार और शुद्धता के स्तर8. सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित दृष्टिकोण उनकी सादगी और कम लागत के कारण सबसे लोकप्रिय हैं। हालांकि अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन में कम माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता प्राप्त करने का नुकसान होता है और अधिक जटिल घनत्व ढाल-आधारित अनुप्रयोगों का उपयोग किए जाने पर बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है। हाल के वर्षों में, माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए नए तरीके सामने आए हैं, जैसे टैग-आधारित प्रतिरक्षा कैप्चर (“मिटो-आईपी”)9 और प्रतिदीप्ति-सक्रिय ऑर्गेनेल सॉर्टिंग10। यद्यपि दोनों प्रक्रियाएं उच्च शुद्धता के साथ नमूने उत्पन्न कर सकती हैं, पूर्व को आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को टैग करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है, जिससे प्रोटोकॉल असंशोधित जीवों या मानव दाताओं से प्राथमिक सामग्री के साथ असंगत हो जाते हैं। इस बीच, उत्तरार्द्ध प्रवाह साइटोमेट्री और सॉर्टिंग उपकरणों तक पहुंच पर निर्भर है। विभिन्न अलगाव विधियों का संयोजन अधिक मजबूत प्रोटोकॉल और बढ़ी हुई शुद्धता उत्पन्न करने का वादा प्रदान करता है।
यहां, हम दो मौजूदा तरीकों के संयोजन के आधार पर माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: (1) एक कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश को अलग करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन, और (2) बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 22 (टॉम 22)11, एक सर्वव्यापी माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी-झिल्ली प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी से बंधे सुपरपैरामैग्नेटिक मोतियों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया का टैग-मुक्त प्रतिरक्षा कैप्चर (चित्रा 1). हम जिस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं वह मात्रात्मक प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संगत है, और क्योंकि यह टैग-मुक्त है और आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता नहीं है, इसे सेल लाइनों से शरीर के तरल पदार्थ से पूरे पशु ऊतकों तक अनुसंधान मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में दो चरणों का उपयोग उपन्यास माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज और उनकी अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए घटाव प्रोटिओमिक्स 6,12 के उपयोग को सक्षम बनाता है।
हमने माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए बेहतर शुद्धता प्राप्त करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और इम्यूनोकैप्चर को जोड़ा है। हमारी प्रक्रिया उपन्यास माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए प्राथमिक सामग्री तक पहुंच की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल सीधा और मजबूत है, और आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता के बिना सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। हमने शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान विभिन्न चरणों में लिए गए नमूनों पर इम्यूनोब्लॉटिंग और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण द्वारा हमारे प्रोटोकॉल को मान्य किया है।
एकल अलगाव विधियों की तुलना में, विभिन्न प्रकृति के संवर्धन चरणों का संयोजन – यहां, सेंट्रीफ्यूजेशन और प्रतिरक्षा लेबलिंग – माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए एक अधिक मजबूत प्रोटोकॉल उत्पन्न करता है। ऐसा इसलिए है, क्योंकि जबकि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन दोनों शुद्धिकरण में समृद्ध हो जाएंगे, यह संभावना नहीं है कि दोनों संवर्धन चरणों के बाद दूषित पदार्थों को भी समृद्ध किया जाएगा। यद्यपि उच्च माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा भी प्राप्त की जा सकती है, इस दृष्टिकोण के लिए बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज तक पहुंच की आवश्यकता होती है। अंत में, टैग-आधारित माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव20 पर आधारित हालिया तरीकों के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण को नमूने के आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता नहीं है, जिससे यह किसी भी स्रोत से प्राथमिक सामग्री के लिए उपयुक्त है।
हमारे प्रोटोकॉल को लागू करते समय प्रयोगात्मक डिजाइन में कुछ तकनीकी और जैविक विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। (1) पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सामग्री की मात्रा महत्वपूर्ण है। अनिवार्य रूप से, होमोजेनाइजेशन (चरण 3.10) के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया की एक छोटी संख्या खो जाएगी, क्योंकि सभी कोशिकाओं को लाइसिस नहीं किया जाता है, या तीन कॉलम वॉश (चरण 4.6) के दौरान। जबकि हमारा प्रोटोकॉल उपज पर शुद्धता पर केंद्रित है, माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव की दक्षता, और इसलिए उनकी उपज, को मापा या अनुकूलित नहीं किया गया है। अधिक टॉम 22 मोतियों और अधिक कॉलम का उपयोग करने से माइटोकॉन्ड्रिया वसूली की उपज में वृद्धि होने की उम्मीद है। इसी समय, होमोजेनाइजेशन चरण का एक संपूर्ण अनुकूलन भी माइटोकॉन्ड्रियल उपज में सुधार कर सकता है। यह प्रोटोकॉल और प्रारंभिक सेल नंबर जो हम रॉ 264.7 कोशिकाओं और बीएमडीएम के लिए यहां रिपोर्ट करते हैं, प्रोटिओमिक्स के लिए पर्याप्त हैं और अन्य अनुप्रयोगों के लिए समायोजित किए जा सकते हैं। प्राथमिक बीएमडीएम के मामले में, हमने पाया कि एक प्रतिकृति के लिए एक माउस पर्याप्त था। जब आवश्यक हो, तो प्रक्रिया को कई जानवरों से बीएमडीएम को अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसे तब पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए पूल किया जा सकता है। सेल नंबर को सेल प्रकार, इसके आकार और इसकी माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। (2) टॉम 22 सभी सेल प्रकारों और ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया पर व्यक्त किया जाता है।21, लेकिन इसकी अभिव्यक्ति का स्तर भिन्न हो सकता है। इसलिए, विभिन्न स्थितियों की तुलना करने के लिए एक प्रयोग डिजाइन करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि टॉम 22 के अभिव्यक्ति स्तर तुलनीय हैं। इसके अलावा, टॉम 22 की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के कारण, जटिल ऊतकों के भीतर सेल-प्रकार विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का अध्ययन करना संभव नहीं है। (3) शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया (लगभग 2.5 घंटे) उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय क्षणिक घटनाओं के अध्ययन के साथ असंगत है, जैसे कि चयापचय प्रोफाइल में परिवर्तन। इस मामले में, हम प्रत्यक्ष टैग-आधारित प्रतिरक्षा कैप्चर की सलाह देते हैं।9, जो सेल-प्रकार विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने की भी अनुमति देता है। in vivo20. (4) हालांकि अकेले टॉम 22 एंटीबॉडी-लेबल मोतियों का उपयोग करके प्राप्त पृथक माइटोकॉन्ड्रिया पर अध्ययन ने कार्यात्मक परख में गतिविधि दिखाई है।11, यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि क्या हमारे प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न माइटोकॉन्ड्रिया डाउनस्ट्रीम गतिविधि-आधारित परख के साथ संगत हैं। माइटोट्रैकर या टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर परक्लोरेट (टीएमआरएम) धुंधलापन, या श्वसन-मेपन, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यक्षमता को निर्धारित करने के लिए संभावित दृष्टिकोण हैं।22. (5) कॉलम से “माइटो-प्योर” नमूने को सलामी देने के बाद, कुछ टॉम 22 मोती शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया अंश (चित्र 2B). जबकि हमने ट्रिप्सिन पाचन और प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ कोई हस्तक्षेप नहीं देखा है, इन मोतियों और इम्युनोग्लोबुलिन की उपस्थिति को अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में ध्यान में रखा जाना चाहिए। टॉम 22 एंटीबॉडी चूहों में उत्पादित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है।23, और इसलिए यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, इम्यूनोब्लोटिंग में चूहों के खिलाफ द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, यह इम्युनोग्लोबुलिन श्रृंखलाओं के आकार में विशिष्ट बैंड उत्पन्न करेगा। (6) कोशिका निलंबन का पूर्ण समरूपीकरण माइटोकॉन्ड्रिया के सफल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम RAW264.7 कोशिकाओं और BMDM दोनों को अलग करने के लिए 25 ग्राम सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करते हैं। हालांकि, सेल प्रकार और इसके आकार के आधार पर, अन्य यांत्रिक होमोजेनाइज़ेशन विधियां, जैसे कि डोंस होमोजेनाइज़र का उपयोग, या सेल होमोजेनाइज़र उपकरणों जैसे अधिक नियंत्रित दृष्टिकोण, अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। गैर-यांत्रिक समरूपीकरण विधियों, जैसे कि कोमल सोनिकेशन, पर भी विचार किया जा सकता है। ऊतक समरूपीकरण दृष्टिकोण अन्य अध्ययनों में आगे चर्चा की जाती है।24,25. (7) हालांकि इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा सत्यापन सबसे सीधा और सस्ता तरीका है, इसके परिणाम हमेशा पूरे ऑर्गेनेल स्तर पर परिवर्तन के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकते हैं। यही कारण है कि हम क्रमशः माइटोकॉन्ड्रिया और अन्य ऑर्गेनेल के संवर्धन या कमी को पूरी तरह से मान्य करने के लिए प्रोटिओमिक्स का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
यहां वर्णित दो-चरण माइटोकॉन्ड्रिया शुद्धिकरण प्रोटोकॉल ने हमें माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता बढ़ाने के साथ अनुक्रमिक नमूने उत्पन्न करने की अनुमति दी है, और इसने हमें घटाव प्रोटिओमिक्स12 के माध्यम से नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन उम्मीदवारों की खोज करने में सक्षम बनाया है। हमारे विश्लेषण के लिए, हम काफी समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का चयन करने के लिए कड़े थ्रेसहोल्ड का उपयोग करते हैं, और हालांकि यह कुछ ज्ञात माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (चित्रा 3 ए) की पहचान करने में विफल हो सकता है, नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज के लिए झूठी-सकारात्मक दर कम हो जाती है। फिर भी, यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि हमारे प्रोटोकॉल द्वारा प्रकट किसी भी उम्मीदवार प्रोटीन को ऑर्थोगोनल दृष्टिकोण के माध्यम से मान्य किया जाना चाहिए। हम कार्बोक्सी-टर्मिनल जीएफपी-टैगिंग या अंतर्जात प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के उपयोग की सलाह देते हैं ताकि माइटोकॉन्ड्रिया के साथ संबंध को सूक्ष्म रूप से या प्रोटीज संरक्षण परख द्वारा मान्य किया जा सके।
असंशोधित कोशिकाओं और ऊतकों के मामले में हमारी विधि का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग यह जांचने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है कि स्वस्थ और रोग स्थितियों में माइटोकॉन्ड्रिया कैसे बदलते हैं और अपने पर्यावरण के अनुकूल होते हैं। सेल लाइनों, पशु रोग मॉडल, मानव तरल पदार्थ, और यहां तक कि सर्जरी से बायोप्सी के लिए हमारे प्रोटोकॉल का आवेदन माइटोकॉन्ड्रिया और उनके संबंधित विकारों की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी साबित हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम उनकी मदद के लिए लॉज़ेन विश्वविद्यालय में मैनफ्रेडो क्वाड्रोनी, प्रोटीन विश्लेषण सुविधा और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि पर सलाह और प्रतिक्रिया के लिए एचजी स्प्रेंजर, के मौंड्रेल और जॉर्डन प्रयोगशाला के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को फाउंडेशन पियरे-मर्सियर पोर ला साइंस और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (परियोजना अनुदान 310030_200796) द्वारा समर्थित किया गया था।
1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
Sucrose | Sigma | S1888 | |
Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |