Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

Summary

Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.

Abstract

In eukaryotischen Zellen werden Membrankomponenten, darunter Proteine und Lipide, innerhalb des Endomembransystems räumlich und zeitlich an ihren Bestimmungsort transportiert. Dazu gehören der sekretorische Transport von neu synthetisierten Proteinen an die Zelloberfläche oder die Außenseite der Zelle, der endozytäre Transport von extrazellulären Ladungen oder Plasmamembrankomponenten in die Zelle und das Recycling oder der Shuttletransport von Ladungen zwischen den subzellulären Organellen usw. Membrantransportereignisse sind entscheidend für die Entwicklung, das Wachstum und die Anpassung an die Umwelt aller eukaryotischen Zellen und unterliegen daher einer strengen Regulierung. Zelloberflächenrezeptorkinasen, die Ligandensignale aus dem extrazellulären Raum wahrnehmen, durchlaufen sowohl sekretorischen als auch endozytären Transport. Häufig verwendete Ansätze zur Untersuchung der Membrantransportereignisse unter Verwendung einer Plasmamembran-lokalisierten Leucin-Rich-Repeat-Rezeptorkinase, ERL1, werden hier beschrieben. Zu den Ansätzen gehören die Vorbereitung des Pflanzenmaterials, die pharmakologische Behandlung und die konfokale Bildgebung. Um die räumlich-zeitliche Regulation von ERL1 zu überwachen, beschreibt diese Arbeit die Kolokalisationsanalyse zwischen ERL1 und einem multivesikulären Körpermarkerprotein, RFP-Ara7, die Zeitreihenanalyse dieser beiden Proteine und die Z-Stapel-Analyse von ERL1-YFP, die mit den Membrantransportinhibitoren Brefeldin A und Wortmannin behandelt wurde.

Introduction

Der Membrantransport ist ein konservierter zellulärer Prozess, der Membrankomponenten (auch bekannt als Frachten), einschließlich Proteine, Lipide und andere biologische Produkte, zwischen verschiedenen Organellen innerhalb einer eukaryotischen Zelle oder über die Plasmamembran zum und vom extrazellulären Raum verteilt¹. Dieser Prozess wird durch eine Ansammlung von Membranen und Organellen erleichtert, die als Endomembransystem bezeichnet werden und aus der Kernmembran, dem endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, den Vakuolen/Lysosomen, der Plasmamembran und mehreren Endosomen bestehen¹. Das Endomembransystem ermöglicht die Modifikation, Verpackung und den Transport von Membrankomponenten mithilfe dynamischer Vesikel, die zwischen diesen Organellen pendeln. Membrantransportereignisse sind entscheidend für die Zellentwicklung, das Wachstum und die Anpassung an die Umwelt und unterliegen daher einer strengen und komplexen Regulierung². Derzeit wurden mehrere Ansätze in der Molekularbiologie, der chemischen Biologie, der Mikroskopie und der Massenspektrometrie entwickelt und auf das Gebiet des Membrantransports angewendet und haben das Verständnis der raumzeitlichen Regulation des Endomembransystems erheblich vorangebracht ^3,4. Die Molekularbiologie wird für klassische genetische Manipulationen der mutmaßlichen Akteure verwendet, die am Membrantransport beteiligt sind, wie z. B. die Veränderung der Genexpression des interessierenden Proteins oder die Markierung des interessierenden Proteins mit bestimmten Markierungen. Zu den Werkzeugen in der chemischen Biologie gehört die Verwendung von Molekülen, die spezifisch in den Verkehr bestimmter Routen eingreifen ^4,5. Die Massenspektrometrie ist leistungsfähig für die Identifizierung der Komponenten in einer Organelle, die durch biochemische Ansätze mechanisch isoliert wurde ^3,4. Der Membranverkehr ist jedoch ein dynamischer, vielfältiger und komplexer biologischer Prozess¹. Um den Prozess des Membrantransports in lebenden Zellen unter verschiedenen Bedingungen sichtbar zu machen, ist die Lichtmikroskopie ein wesentliches Werkzeug. Kontinuierliche Fortschritte wurden bei fortschrittlichen Mikroskoptechniken erzielt, um die Herausforderungen bei der Messung der Effizienz, Kinetik und Vielfalt der Ereignisse zu bewältigen⁴. Hier konzentriert sich diese Studie auf die weit verbreiteten Methoden in der chemischen/pharmakologischen Biologie, Molekularbiologie und Mikroskopie, um Membrantransportereignisse in einem natürlich vereinfachten und experimentell zugänglichen System, dem stomatären Entwicklungsprozess, zu untersuchen.

Spaltöffnungen sind Mikroporen auf pflanzlichen Luftoberflächen, die sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch zwischen den inneren Zellen und der Umgebung zu erleichtern ^6,7,8. Daher sind Spaltöffnungen essentiell für die Photosynthese und Transpiration, zwei Ereignisse, die für das Überleben und Wachstum von Pflanzen entscheidend sind. Die Stomaentwicklung wird dynamisch durch Umwelteinflüsse angepasst, um die Anpassung der Pflanze an die Umgebung zu optimieren⁹. Die Identifizierung des Rezeptorproteins Too Many Mouths (TMM) aus dem Jahr 2002 eröffnete eine neue Ära der Erforschung der molekularen Mechanismen der Stomataentwicklung in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana¹⁰. Bereits nach wenigen Jahrzehnten wurde ein klassischer Signalweg identifiziert. Von Upstream zu Downstream umfasst dieser Signalweg eine Gruppe von sekretorischen Peptidliganden aus der Familie der epidermalen Musterungsfaktoren (EFP), mehrere Zelloberflächen-Leucin-Rich-Repeat (LRR)-Rezeptorkinasen in der EREECTA (ER)-Familie, das LRR-Rezeptorprotein TMM, eine MAPK-Kaskade und mehrere bHLH-Transkriptionsfaktoren, darunter SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA und SCREAM (SCRM)^11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass eine der Rezeptorkinasen, ER-LIKE 1 (ERL1), aktives subzelluläres Verhalten bei EPF-Wahrnehmung zeigt²⁰. ERL2 transportiert auch dynamisch zwischen der Plasmamembran und einigen intrazellulären Organellen²⁷. Die Blockierung der Membrantransportschritte führt zu einer abnormen Stomatamusterbildung, die zu Stomataclustern auf der Blattoberfläche^{führt 28}. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Membranverkehr eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung der Spaltöffnungen spielt. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur räumlichen und zeitlichen Untersuchung der ERL1-Dynamik mittels Protein-Protein-Subzellulär-Kolokalisationsanalyse in Kombination mit pharmakologischer Behandlung mit einigen Membrantransportinhibitoren.

Protocol

1. Vorbereitung der Lösungen Bereiten Sie die Saatgutsterilisationslösung vor, indem Sie 15 ml Bleichmittel mit 35 ml destilliertem Wasser und 50 μl Triton X-100 mischen. Bereiten Sie Brefeldin A (BFA)-Lösung vor, indem Sie das BFA-Pulver in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 10 mM (Stamm) auflösen. Bereiten Sie die Wortmannin (Wm)-Lösung vor, indem Sie das Wm-Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 10 mM (Stamm) auflösen. 2. …

Representative Results

Eine frühere Studie deutete darauf hin, dass ERL1 eine aktive Rezeptorkinase ist, die dynamische Membrantransportereignisse durchläuft20. ERL1 ist eine Transmembran-LRR-Rezeptorkinase auf der Plasmamembran. Neu synthetisiertes ERL1 im endoplasmatischen Retikulum wird in den Golgi-Körpern prozessiert und weiter zur Plasmamembran transportiert. Die ERL1-Moleküle auf der Plasmamembran können EPF-Liganden mit Hilfe ihrer extrazellulären LRR-Domäne18 wahrnehmen. Nach der …

Discussion

Das Endomembransystem trennt das Zytoplasma einer eukaryotischen Zelle in verschiedene Kompartimente, was die spezialisierte biologische Funktion dieser Organellen ermöglicht. Um Frachtproteine und Makromoleküle zum richtigen Zeitpunkt an ihren endgültigen Bestimmungsort zu bringen, werden zahlreiche Vesikel zwischen diesen Organellen hin- und hergeleitet. Hochregulierte Membrantransportereignisse spielen eine grundlegende Rolle für die Lebensfähigkeit, Entwicklung und das Wachstum von Zellen. Der Mechanismus, der d…

Materials

10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug