Sistema de pseudoislotes humanos para la evaluación sincrónica de la dinámica de biosensores fluorescentes y perfiles de secreción de hormonas
Summary
Este protocolo describe un método para la adquisición sincrónica y el co-registro de eventos de señalización intracelular y la secreción de insulina y glucagón por pseudoislotes humanos primarios utilizando la administración adenoviral de un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), un detector de diferencia de cAMP in situ (cADDis) y un sistema de microperifusión.
Abstract
Los islotes pancreáticos de Langerhans, que son pequeñas colecciones 3D de células endocrinas y de soporte especializadas intercaladas por todo el páncreas, tienen un papel central en el control de la homeostasis de la glucosa a través de la secreción de insulina por parte de las células beta, que reduce la glucosa en sangre, y glucagón por parte de las células alfa, que eleva la glucosa en sangre. Las vías de señalización intracelular, incluidas las mediadas por AMPc, son clave para la secreción regulada de hormonas alfa y beta de las células. La estructura 3D de los islotes, si bien es esencial para la función coordinada de los islotes, presenta desafíos experimentales para los estudios mecanicistas de las vías de señalización intracelular en las células primarias de los islotes humanos. Para superar estos desafíos y limitaciones, este protocolo describe una plataforma integrada de imágenes de células vivas y microfluídica que utiliza pseudoislotes humanos primarios generados a partir de donantes sin diabetes que se asemejan a los islotes nativos en su morfología, composición y función. Estos pseudoislotes están controlados por tamaño a través del proceso de dispersión y reagregación de las células primarias de los islotes humanos. En el estado disperso, la expresión génica de las células de los islotes se puede manipular; por ejemplo, se pueden introducir biosensores como el biosensor de AMPc codificado genéticamente, cADDis. Una vez formados, los pseudoislotes que expresan un biosensor codificado genéticamente, en combinación con la microscopía confocal y una plataforma de microperifusión, permiten la evaluación sincrónica de la dinámica de los biosensores fluorescentes y los perfiles de secreción de hormonas de las células alfa y beta para proporcionar más información sobre los procesos y la función celular.
Introduction
Los islotes de Langerhans son mini órganos repartidos por todo el páncreas cuya función es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. La insulina es secretada por las células beta tras el metabolismo de la glucosa, el aumento de la relación ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio sensibles al ATP, la despolarización de la membrana plasmática y la entrada de calcio extracelular. La secreción de glucagón de las células alfa es menos conocida, pero se ha postulado que las vías intracelulares y paracrinas contribuyen a la exocitosis de los gránulos de glucagón 2,3,4. Tanto la diabetes tipo 1 como la diabetes tipo 2 se asocian con disfunción de las células de los islotes 5,6,7. Por lo tanto, dilucidar las vías de señalización intracelular que median la secreción de hormonas de los islotes es esencial para comprender los mecanismos fisiológicos y patológicos en los islotes pancreáticos.
La arquitectura esférica de los islotes presenta ciertos obstáculos para la experimentación. Estos desafíos incluyen la variación del tamaño de los islotes y la naturaleza 3D de los islotes, lo que reduce la transducción viral dentro del núcleo del islote 8,9. Para superar estos desafíos, se desarrolló un sistema de pseudoislotes, en el que los islotes humanos primarios se dispersan en células individuales, se transducen adenoviralmente con construcciones que codifican objetivos de interés y se vuelven a agregar para formar estructuras similares a islotes de tamaño controlado denominadas pseudoislotes7. En comparación con los islotes nativos del mismo donante que se han cultivado en paralelo, estos pseudoislotes son similares en morfología, composición de células endocrinas y secreción de hormonas7. Este método permite la expresión de constructos a lo largo del pseudoislote, lo que significa que supera una barrera previa para la manipulación genética uniforme de los islotes humanos primarios 7,8,9.
En este protocolo, el sistema de pseudoislotes se integra con un dispositivo microfluídico para expresar biosensores en células primarias de islotes humanos y obtener resolución temporal de la secreción de hormonas de pseudoislotes durante la perifusión dinámica10,11,12. Los pseudoislotes se colocan en un microchip y se exponen a un flujo constante de diferentes secretagogos a través de una bomba peristáltica12. El microchip tiene un fondo de vidrio transparente y está montado en un microscopio confocal para registrar la dinámica de señalización intracelular a través de cambios en la intensidad de fluorescencia del biosensor. Las imágenes de los biosensores se sincronizan con la recogida del efluente de microperifusión para el posterior análisis de la secreción de insulina y glucagón7. En comparación con la macroperifusión, este enfoque de microperifusión permite utilizar menos pseudoislotes debido al menor volumen del dispositivo microfluídico en comparación con la cámara de macroperifusión7.
Para aprovechar la utilidad de este sistema, se expresó el biosensor detector de diferencias in situ de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) (cADDis) en pseudoislotes humanos para evaluar la dinámica del AMPc y la secreción de hormonas. El biosensor cADDis está compuesto por una proteína verde fluorescente permutada circularmente (cpGFP) posicionada en la región bisagra de una proteína de intercambio activada por cAMP 2 (EPAC2), conectando sus regiones reguladoras y catalíticas. La unión del AMPc a la región reguladora de EPAC2 provoca un cambio conformacional en la región de bisagra que aumenta la fluorescencia del cpGFP13. Los mensajeros intracelulares, como el AMPc, provocan la secreción de insulina y glucagón después de la activación ascendente de los receptores acoplados a proteínas G14. Las imágenes de células vivas junto con la microperifusión ayudan a conectar la dinámica intracelular del AMPc con la secreción de hormonas de los islotes. En concreto, en este protocolo se generan pseudoislotes que expresan cADDis para monitorizar las respuestas de AMPc en células alfa y beta a diversos estímulos: glucosa baja (2 mM de glucosa; G 2), glucosa alta más isobutilmetilxantina (IBMX; 20 mM de glucosa + 100 μM de IBMX; G 20 + IBMX) y glucosa baja más epinefrina (Epi; 2 mM de glucosa + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Este flujo de trabajo de tratamiento permite la evaluación de la dinámica del AMPc intracelular directamente a través de 1) la inhibición de la fosfodiesterasa mediada por IBMX, que mejora los niveles intracelulares de AMPc al prevenir su degradación, y 2) la epinefrina, un conocido estimulador dependiente del AMPc de la secreción de glucagón de las células alfa mediada por la activación del receptor β-adrenérgico. A continuación se detallan los pasos para configurar el aparato de microperifusión para experimentos de imágenes de células vivas, la carga de los pseudoislotes en el microchip, la obtención de imágenes sincrónicas de células vivas y la microperifusión, y el análisis de las trazas de biosensores y la secreción de hormonas mediante ensayos hormonales basados en microplacas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La integración de un sistema de microperifusión, pseudoislotes que expresan biosensores y microscopía confocal de barrido láser permite la evaluación sincrónica de los eventos de señalización intracelular y los perfiles dinámicos de secreción de hormonas. El sistema dinámico de microperifusión puede entregar una serie de estímulos bien definidos a los pseudoislotes y permite la recolección del efluente, en el que las concentraciones de insulina y glucagón pueden medirse mediante ELISA disponible comercialm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los donantes de órganos y sus familias son apreciados por sus valiosas donaciones, y el Instituto Internacional de Organizaciones de Obtención de Órganos, Avance de la Medicina (IIAM) y el Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (NDRI) son reconocidos por su asociación para hacer que el tejido pancreático humano sea accesible para la investigación. Este trabajo contó con el apoyo de la Red de Investigación de Islotes Humanos (RRID:SCR_014393), el Programa de Análisis del Páncreas Humano (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 y DK20593 (Centro de Investigación y Capacitación sobre la Diabetes de Vanderbilt), el Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, el Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (BX000666), el NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 y la Beca de Investigación de Posgrado (1937963) de la Fundación Nacional de Ciencias.
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
Riferimenti
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