Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.
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Articolo metodologico
Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio in vitro della differenziazione degli adipociti bianchi, marroni e beige consente lo studio delle funzioni autonome cellulari degli adipociti e dei loro meccanismi. Le linee cellulari di preadipociti bianchi immortalizzati sono pubblicamente disponibili e ampiamente utilizzate. Tuttavia, l'emergere di adipociti beige nel tessuto adiposo bianco in risposta a segnali esterni è difficile da ricapitolare nella misura completa utilizzando linee cellulari di adipociti bianchi disponibili al pubblico. L'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino viene comunemente eseguito per ottenere preadipociti primari ed eseguire la differenziazione degli adipociti. Tuttavia, la tritatura e la digestione della collagenasi del tessuto adiposo a mano possono provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione. Qui, presentiamo un protocollo semi-automatico modificato che utilizza un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF, con l'obiettivo di ridurre la variazione sperimentale, ridurre la contaminazione e aumentare la riproducibilità. I adipociti ottenuti e gli adipociti differenziati possono essere utilizzati per analisi funzionali e meccanicistiche.
Introduzione
La biologia del tessuto adiposo ha attirato un'attenzione sempre maggiore a causa della crescente prevalenza dell'obesità e del diabete di tipo 2 a livello globale1. Gli adipociti immagazzinano l'energia in eccesso sotto forma di goccioline lipidiche, che vengono rilasciate per fame. Inoltre, il tessuto adiposo mantiene l'omeostasi energetica sistemica fungendo da organo endocrino e comunicando con altri tessuti 2,3. Curiosamente, sia l'eccesso di tessuto adiposo (obesità) che la perdita adiposa (lipodistrofia) sono legati all'insulino-resistenza e al diabete1. G....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Tokyo ed eseguiti secondo le linee guida istituzionali dell'Università di Tokyo.
1. Preparazione della soluzione enzimatica e del mezzo
- Mettere entrambi i lati del tessuto adiposo bianco inguinale (lato destro e sinistro, circa 150 mg) da un topo di 7-8 settimane e 2,5 ml di soluzione enzimatica nel tubo C del dissociatore.
- Ricostituire l'enzima D con 3 ml di terreno di aquila modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco senza siero fetale bovino (FBS) o....
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Risultati
Questo protocollo produce adipociti completamente differenziati e carichi di lipidi 7 giorni dopo aver indotto la differenziazione degli adipociti. Il grado di differenziazione degli adipociti può essere valutato mediante la colorazione rosso olio di trigliceridi e lipidi (Figura 1A), o l'analisi dell'espressione dell'mRNA utilizzando qPCR-RT di geni adipocitari, come il regolatore principale dell'adipogenesi Pparg e il suo target Fabp4 (Figura 1B).
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Discussione
Qui, abbiamo descritto un protocollo per l'isolamento della SVF dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti ed eseguire la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi ha ridotto la variazione sperimentale, diminuito il rischio di contaminazione e aumentato la riproducibilità. Sebbene questa procedura sia un passaggio critico all'interno del protocollo presentato, il processo è altamente automatizzato e non è necessaria l'ottimizzazion.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha un interesse finanziario concorrente relativo a questo lavoro.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Takahito Wada e Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Giappone) per la loro assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni a Y.H.: borsa di ricerca dell'Università di Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numero di sovvenzione 19K17976; sovvenzione per il Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) della Japan Foundation for Applied Enzymology, numero di sovvenzione 17F005; borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Farmacologica; sovvenzione della Mochida Memorial Foundation f....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra da 100 mm | Corning | 430167 | |
| Piastra a 12 pozzetti | Corning | 3513 | |
| Piastra da 60 mm | IWAKI | 3010-060 | |
| Kit di dissociazione del tessuto adiposo, topo e ratto | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contenuto: Enzima D, Enzima R, Enzima A e tampone A |
| Filtro cellulare 70 &; m | BD falcon | #352350 | |
| Piastre rivestite di collagene, 100 mm | BD | #356450 | |
| Piastre rivestite di collagene, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagene I Coat Micropiastra a 6 pozzetti | IWAKI | 4810-010 | |
| Desametasone | Wako | 041-18861 | |
| Pinze da dissezione | N/A | N/A | autoclave prima dell'uso |
| Forbici da dissezione, smussate/affilate | N/A | N/A | autoclave prima dell'uso |
| Forbici da dissezione, affilate/affilate | N/A | N/A | autoclave prima dell'uso |
| DMEM/F-12, integratore GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| delicatoMACSOcto dissociatore con riscaldatori | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Iniezione U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indometacina | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutilmetilxantina (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomicina Solfato | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS compresse | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retrovirale Packaging Linea | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.
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Ristampe e permessi
