Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator
Summary
Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.
Abstract
De in vitro studie van witte, bruine en beige adipocytendifferentiatie maakt het mogelijk om celautonome functies van adipocyten en hun mechanismen te onderzoeken. Vereeuwigde witte preadipocytencellijnen zijn openbaar beschikbaar en worden veel gebruikt. De opkomst van beige adipocyten in wit vetweefsel als reactie op externe signalen is echter moeilijk volledig samen te vatten met behulp van openbaar beschikbare witte adipocytencellijnen. Isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel wordt vaak uitgevoerd om primaire preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie uit te voeren. Het hakken en collagenaseverteren van vetweefsel met de hand kan echter resulteren in experimentele variatie en is gevoelig voor besmetting. Hier presenteren we een aangepast semi-geautomatiseerd protocol dat een weefseldissociator gebruikt voor collagenasevertering om een eenvoudigere isolatie van de SVF te bereiken, met als doel experimentele variatie te verminderen, verontreiniging te verminderen en de reproduceerbaarheid te vergroten. De verkregen preadipocyten en gedifferentieerde adipocyten kunnen worden gebruikt voor functionele en mechanistische analyses.
Introduction
Vetweefselbiologie trekt steeds meer aandacht vanwege de groeiende prevalentie van obesitas en diabetes type 2 wereldwijd1. Adipocyten slaan overtollige energie op in de vorm van lipidedruppeltjes, die vrijkomen bij uithongering. Bovendien handhaaft vetweefsel systemische energiehomeostase door te dienen als een endocrien orgaan en te communiceren met andere weefsels 2,3. Intrigerend is dat zowel overtollig vetweefsel (obesitas) als vetverlies (lipodystrofie) verband houden met insulineresistentie en diabetes1. Adipocyten zijn onderverdeeld in drie soorten: wit, bruin en beige1. Witte adipocyten slaan voornamelijk overtollige energie op als lipiden, terwijl bruine en beige adipocyten energie in de vorm van warmte afvoeren via mitochondriaal ontkoppelingseiwit-1 (Ucp1)1,4. Met name beige adipocyten (ook wel “induceerbare” bruine adipocyten genoemd) verschijnen in wit vetweefsel als reactie op koude of sympathische stimulatie en vertonen genexpressiepatronen die overlappen met maar verschillen van die van “klassieke” bruine adipocyten5. Onlangs zijn bruine en beige adipocyten verwacht als potentiële doelwitten van anti-obesitas en anti-diabetes behandelingen gericht op “het verbeteren van de energiedissipatie” in plaats van “het onderdrukken van de energie-inname”4. Ondersteunend wordt gemeld dat het risico-allel van de FTO-obesitasvariant rs1421085 bij mensen, dat de sterkste associatie vertoont met een hogere body mass index (BMI) onder veel voorkomende varianten6,7 en verschillende gen-omgevingsinteracties vertoont 8,9, de beige adipocytendifferentiatie en -functie negatief reguleert10. Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) staat bekend als een master transcriptionele regulator van adipogenesis en is noodzakelijk en voldoende voor adipocytendifferentiatie11. Transcriptionele regulatoren, zoals PRD1-BF1-RIZ1 homoloog domein met 16 (PRDM16), vroege b-celfactor 2 (EBF2) en nucleaire factor I-A (NFIA), zijn cruciaal voor bruine en beige adipocytendifferentiatie en functie 12,13,14,15,16,17,18. Aan de andere kant vereist witte adipocytengenprogrammering transcriptionele regulatoren, zoals transducine-achtig versterkereiwit 3 (TLE3) en zinkvingereiwit 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro modelsystemen maken het mogelijk om moleculaire studies uit te voeren die gericht zijn op het verbeteren van het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de functies en disfuncties van adipocyten. Hoewel openbaar beschikbare en vereeuwigde preadipocytencellijnen zoals 3T3-L1 en 3T3-F442A 22,23,24 bestaan, zou de cultuur van primaire preadipocyten en differentiatie in adipocyten een geschikter model zijn voor het bestuderen van in vivo adipogenese. Isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel is een bekende methode voor het verkrijgen van primaire preadipocyten25,26. Collagenasevertering van vetweefsel, die vaak wordt uitgevoerd met behulp van een bacteriële shaker met een buizenrek, kan echter resulteren in experimentele variatie en is gevoelig voor besmetting27,28. Hier beschrijven we een alternatief protocol dat een zachte magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) weefseldissociator gebruikt voor collagenasevertering om gemakkelijker isolatie van de SVF te bereiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven we een protocol voor isolatie van de SVF uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro uit te voeren. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering verminderde de experimentele variatie, verminderde het risico op besmetting en verhoogde reproduceerbaarheid. Hoewel deze procedure een cruciale stap is binnen het gepresenteerde protocol, is het proces sterk geautomatiseerd en is optimalisatie niet nodig. Afhankelijk van de leeftijd van de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Takahito Wada en Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Japan) bedanken voor hun experimentele hulp. Dit werk werd gefinancierd door de volgende beurzen aan Y.H.: onderzoeksbeurs van het University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, subsidienummer 19K17976; subsidie voor de Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) van de Japan Foundation for Applied Enzymology, subsidienummer 17F005; subsidie van de Stichting Farmacologisch Onderzoek; subsidie van de Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; subsidie van de MSD Life Science Foundation; subsidie van de Daiwa Securities Health Foundation; subsidie van de Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research subsidie van de Takeda Science Foundation; en subsidie van de SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
