פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.
המחקר במבחנה של התמיינות אדיפוציט לבן, חום ובז’ מאפשר לחקור פונקציות אוטונומיות תאיות של אדיפוציטים ומנגנוניהם. קווי תאים קדם-אדיפוציטיים לבנים אימורטליים זמינים לציבור ונמצאים בשימוש נרחב. עם זאת, הופעתם של אדיפוציטים בצבע בז’ ברקמת השומן הלבן בתגובה לרמזים חיצוניים קשה לשחזר את מלוא ההיקף באמצעות קווי תאי אדיפוציט לבנים הזמינים לציבור. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן מורין מבוצע בדרך כלל כדי להשיג preadipocytes ראשוני ולבצע התמיינות אדיפוציט. עם זאת, טחינה ועיכול collagenase של רקמת שומן ביד יכול לגרום לשינויים ניסיוניים נוטה לזיהום. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי שונה המשתמש בדיסוציאטור רקמות לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF, במטרה להפחית את השונות הניסיונית, להפחית את הזיהום ולהגדיל את יכולת השחזור. ניתן להשתמש בפראדיפוציטים המתקבלים ובאדיפוציטים מובחנים לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים.
ביולוגיה של רקמת השומן מושכת תשומת לב הולכת וגוברת בגלל השכיחות הגוברת של השמנת יתר וסוכרת מסוג 2 ברחבי העולם1. אדיפוציטים מאחסנים אנרגיה עודפת בצורה של טיפות שומנים, אשר משתחררים עם רעב. יתר על כן, רקמת השומן שומרת על הומאוסטזיס אנרגיה מערכתית על ידי משמש כאיבר אנדוקריני ותקשורת עם רקמות אחרות 2,3. באופן מסקרן, גם עודף רקמת שומן (השמנת יתר) וגם אובדן שומן (ליפודיסטרופיה) קשורים לתנגודת לאינסולין ולסוכרת1. אדיפוציטים מחולקים לשלושה סוגים: לבן, חום ובז’1. אדיפוציטים לבנים מאחסנים בעיקר אנרגיה עודפת כשומנים, בעוד שאדיפוציטים חומים ובז’ מפזרים אנרגיה בצורה של חום באמצעות חלבון פירוק צימוד מיטוכונדריאלי-1 (Ucp1)1,4. יש לציין כי אדיפוציטים בצבע בז’ (המכונים גם אדיפוציטים חומים “מושרים”) מופיעים ברקמת השומן הלבנה בתגובה לגירוי קר או סימפתטי ומציגים דפוסי ביטוי גנים החופפים אך נבדלים מאלה של אדיפוציטים חומים “קלאסיים”5. לאחרונה, אדיפוציטים חומים ובז’ נחזו כמטרות פוטנציאליות לטיפולים נגד השמנת יתר ונגד סוכרת שמטרתם “לשפר את פיזור האנרגיה” במקום “לדכא את צריכת האנרגיה”4. באופן תומך, אלל הסיכון של וריאנט ההשמנה FTO rs1421085 בבני אדם, אשר מציג את הקשר החזק ביותר עם מדד מסת גוף גבוה יותר (BMI) בקרב וריאנטים נפוצים 6,7 ומציג אינטראקציות גנטיות-סביבתיות שונות 8,9, מדווח לווסת באופן שלילי התמיינות ותפקוד אדיפוציט בז ‘10. Peroxisome proliferator-activated receptor-active receptor γ (PPARγ) ידוע כמווסת שעתוק ראשי של אדיפוגנזה והוא הכרחי ומספיק להתמיינות אדיפוציטים11. וסתי שעתוק, כגון PRD1-BF1-RIZ1 תחום הומולוגי המכיל 16 (PRDM16), גורם תא B מוקדם 2 (EBF2) וגורם גרעיני I-A (NFIA), חיוניים להתמיינות ותפקוד אדיפוציט חום ובז’ 12,13,14,15,16,17,18. מצד שני, תכנות גנים של אדיפוציט לבן דורש מווסתי שעתוק, כגון חלבון משפר דמוי מתמר 3 (TLE3) וחלבון אצבע אבץ 423 (ZFP423)19,20,21.
מערכות מודל במבחנה מאפשרות לבצע מחקרים מולקולריים שמטרתם לשפר את ההבנה של המנגנונים העומדים בבסיס התפקודים והתפקוד הלקוי של אדיפוציטים. למרות שקווי תאים קדם-אדיפוציטיים זמינים לציבור ואימורטליים כגון 3T3-L1 ו- 3T3-F442A קיימים22,23,24, התרבית של קדם-אדיפוציטים ראשוניים והתמיינות לאדיפוציטים תהיה מודל מתאים יותר לחקר אדיפוגנזה in vivo. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן murine היא שיטה ידועה להשגת preadipocytes ראשוני25,26. עם זאת, עיכול collagenase של רקמת שומן, אשר מבוצע בדרך כלל באמצעות שייקר חיידקי עם מדף צינור, יכול לגרום לשונות ניסיונית והוא נוטה לזיהום27,28. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול חלופי המשתמש בדיסוצייאטור רקמה עדין המופעל על ידי מגנטית (MACS) לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF.
כאן, תיארנו פרוטוקול לבידוד של SVF מרקמת שומן מורין כדי לקבל preadipocytes ולבצע התמיינות אדיפוציט במבחנה. השימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז הפחית את השונות הניסיונית, הפחית את הסיכון לזיהום והגדיל את יכולת הרבייה. בעוד הליך זה הוא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול המוצג, התהליך הוא אוטומטי מא?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לטקאהיטו ואדה ולסייקו יושידה (אוניברסיטת טוקיו, טוקיו, יפן) על עזרתם בניסוי. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים לי.ה.: מענק מחקר מתוכנית החוקרים הצעירים המצטיינים של אוניברסיטת טוקיו; האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) KAKENHI מענק סיוע למדענים בתחילת דרכם, מענק מספר 19K17976; מענק ל-Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) מהקרן היפנית לאנזימולוגיה יישומית, מענק מספר 17F005; מענק מהקרן למחקר פרמקולוגי; מענק מקרן הזיכרון Mochida למחקר רפואי ופרמצבטי; מענק מקרן MSD למדעי החיים; מענק מקרן Daiwa Securities Health; מענק מקרן המחקר הביוכימי של טוקיו; מענק מחקר במדעי החיים מקרן טקדה למדע; ומענק מקרן המחקר הרפואי SENSHIN.
100 mm dish | Corning | 430167 | |
12 well plate | Corning | 3513 | |
60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
PBS tablets | Takara | T900 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
T3 | Sigma | T2877-100mg | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |