Сборка и эксплуатация ступени охлаждения для иммобилизации C. elegans на их культуральных пластинах

Summary

В этой статье описываются протоколы построения и эксплуатации стадии охлаждения для массовой иммобилизации C. elegans на их исходных пластинах для выращивания.

Abstract

Подходы к микроскопии in vivo с высоким разрешением могут выявить тонкую информацию и мелкие детали внутри модельного животного Caenorhabditis elegans (C. elegans), но требуют сильной иммобилизации животных для предотвращения размытия изображения при движении. К сожалению, большинство современных методов иммобилизации требуют значительных ручных усилий, что делает визуализацию с высоким разрешением низкопроизводительной. Иммобилизация C. elegans значительно упрощается за счет использования подхода к охлаждению, который может легко обездвижить целые популяции непосредственно на их культивационных пластинах. Ступень охлаждения может устанавливать и поддерживать широкий диапазон температур с равномерным распределением на культивационной пластине. В этой статье задокументирован весь процесс построения ступени охлаждения. Цель состоит в том, чтобы типичный исследователь мог без труда построить операционную ступень охлаждения в своей лаборатории, следуя этому протоколу. Показано использование ступени охлаждения по трем протоколам, и каждый протокол имеет преимущества для разных экспериментов. Также показан пример профиля охлаждения ступени по мере приближения к конечной температуре и несколько полезных советов по использованию охлаждающей иммобилизации.

Introduction

Оптическая микроскопия высокого разрешения является незаменимым инструментом для изучения in vivo биологических структур на субклеточном уровне. Многие биологические исследования требуют визуализации с субмикронным разрешением для определения тонких анатомических деталей, включая морфологию нейронов^1,2, структуру мембраны^3,4 и локализацию белка ^5,6. Изображение с высоким разрешением требует времени экспозиции от нескольких миллисекунд до секунд, в зависимости от способа визуализации и зонда ^7,8. Для достижения оптимальных результатов важно тщательно планировать и проводить эксперименты на основе микроскопии. Решающее значение для этих усилий имеет эффективный метод подготовки животных, который облегчает визуализацию с высоким разрешением.

Нематода C. elegans является широко используемым модельным организмом для изучения многих биологических процессов⁹. Это маленькое животное обычно культивируется на агаровых пластинах нематодной питательной среды (NGM), и они быстро размножаются путем самооплодотворения, что делает их хорошо подходящими для крупномасштабных исследований. Их прозрачность и широкий спектр методов маркировки позволяют легко визуализировать их внутреннюю анатомию^10,11. Тонкие структуры у C. elegans идеально подходят для изучения биологических процессов на субклеточном уровне, таких как регенерация^{нейронов 12}, дегенерация нейронов¹³ и деление^{клеток 14}. Такие исследования требуют визуализации с субмикронным разрешением и иммобилизации животных, достаточно сильной, чтобы предотвратить размытие изображения. Сильная иммобилизация особенно важна для методов, включающих несколько изображений в пространстве или времени, таких как стеки 3D-изображений (т. е. z-стеки) и покадровая съемка. Любое движение животного между экспозициями может затмить результат. Для C. elegans сильная иммобилизация обычно включает ручные манипуляции с отдельными животными и установку их на предметные стекла с помощью анестетика^15,16. Эти трудоемкие и трудоемкие процедуры очень затрудняют проведение крупномасштабных экспериментов. Стратегия иммобилизации, при которой животные непосредственно и обратимо иммобилизуются на своих первоначальных культивационных пластинах, может обеспечить высокопроизводительную визуализацию с высоким разрешением.

Охлаждающая иммобилизация C. elegans была показана в нескольких исследованиях, но широко не используется. Обычно его комбинируют с микрофлюидным устройством для дальнейшего сдерживания животных^17,18,19. Однако микрофлюидные устройства сложны, требуют значительной оперативной подготовки и не могут быть легко интегрированы с типичными рабочими процессами твердого культивирования в экспериментах C. elegans. Таким образом, микрофлюидика не получила широкого распространения для иммобилизации C. elegans. Здесь, в связи с недавней публикацией²⁰ Лаборатории Чунга, представлено введение нового подхода к иммобилизации охлаждения с использованием термоэлектрической ступени охлаждения (рис. 1) для устранения этих недостатков. На стадии охлаждения типичная 60-миллиметровая пластина для выращивания полистирола может быть охлаждена до любой целевой температуры (_{установленной} T) от -8 °C до комнатной температуры. Такой подход на стадии охлаждения может легко и обратимо обездвижить всю популяцию животных с минимальными усилиями пользователя, устраняя 98% времени обработки животных²⁰.

Ниже описаны процедуры построения ступени охлаждения с нуля. Ожидается, что за исключением обработки деталей и 3D-печати, вся процедура займет 4 часа без использования специальных инструментов или опыта. Затем далее описываются три различные стратегии охлаждения с различной скоростью охлаждения и усилиями пользователя по иммобилизации C. elegans на типичном вертикальном микроскопе. Предпочтительная стратегия может зависеть от пользовательского приложения. Подробно описаны протоколы для этих трех стратегий охлаждающей иммобилизации.

Protocol

1. Изготовление и подготовка каждого компонента ступени охлаждения ПРИМЕЧАНИЕ: Ступень охлаждения состоит из нескольких компонентов (см. Таблицу материалов). Большинство комплектующих имеются в готовом виде. Сапфировое окно требует индивидуального заказа, в то время как медная пластина, удерживающий кронштейн и изолирующая пластина могут быть изготовлены на месте с помощью станка с числовым программным управлением или 3D-принтера. После первоначального изготовления последующий процесс сборки занимает около 2-3 часов. Используйте станок с числовым программным управлением для обработки медной пластины из металлического листа из металлической меди размером 170 мм x 120 мм x 3 мм с чистотой 99,9% (рис. 2A). 2D-чертеж для этого производства приведен в дополнительном файле 1. Используйте мелкозернистую наждачную бумагу, чтобы удалить острые края и грязные остатки. Для изготовления удерживающего кронштейна и изолирующей пластины используйте 3D-принтер и нить из полимолочной кислоты (PLA) диаметром 1,75 мм (рис. 2B, C). Для лучшего качества 3D-принтер должен обеспечивать высоту слоя тоньше 0,2 мм.3D модели представлены в дополнительном файле 2 и дополнительном файле 3. 2. Конструирование узла водяного охлаждения Подготовьте силиконовую трубку, отвержденную платиной, бак насоса, медный блок охлаждения и радиатор (рис. 3A) для сборки узла водяного охлаждения. Подготовьте бритвенное лезвие, ножницы и шестигранный ключ к использованию. Помните об опасности поражения электрическим током из-за использования воды во время сборки. Разрежьте силиконовую трубку на три части рекомендуемой длины 40 см, 50 см и 80 см. При необходимости отрегулируйте длину. Вставьте секции силиконовой трубки из шага 2.2 в отверстия радиатора, бака насоса и медного блока охлаждения, как показано на рисунке 3B. Убедитесь, что все соединения водонепроницаемы. В настоящее время построен узел водяного охлаждения. Подготовьте узел водяного охлаждения, блок питания 12 В, три красных и три черных провода-перемычки, макетную плату и 500 мл очищенной воды. Убедитесь, что на верстаке нет жидкости для электробезопасности. Подсоедините бачки насоса и провода радиатора к источнику питания 12 В через макетную плату (рис. 3C). Макетная плата используется для удобства.ПРИМЕЧАНИЕ: Для более постоянного и безопасного соединения исследователи могут заменить макетную плату паяльными проводами. Откройте крышку бака насоса с помощью плоской отвертки. Используйте воронку для добавления воды до тех пор, пока бак насоса не заполнится примерно на 80% (рис. 3D). Не закрывайте бак насоса после этого наполнения. Включите узел водяного охлаждения, подключив блок питания 12 В или включив его (при наличии выключателя). После включения вода будет течь внутрь узла, и вентиляторы на радиаторе должны перегореть. Из-за потока воды из бака насоса уровень жидкости в баке упадет. Добавьте больше воды в бак насоса, пока он не стабилизируется почти на 2/3 (рис. 3E). Встряхните радиатор, чтобы избавиться от пузырьков воздуха, а затем закройте охлаждающий бак. Прежде чем переходить к следующему шагу, выключите источник питания. 3. Испытание холодных и горячих поверхностей Пельтье ПРИМЕЧАНИЕ: Пельтье, ключевой компонент ступени охлаждения, представляет собой твердотельный активный тепловой насос, который передает тепло с одной стороны на другую21. Одна поверхность Пельтье нагревается, а другая поверхность становится холодной при подаче электроэнергии. По умолчанию производители Пельтье маркируют холодную поверхность перед продажей, но все же полезно вручную проверить ее перед сборкой. Подготовьте настраиваемый блок питания и Пельтье, как показано на рисунке 4A. Убедитесь, что настраиваемый источник питания выключен, чтобы предотвратить возможную опасность поражения электрическим током. Подключите красный провод Пельтье к положительному выходу, а черный провод к отрицательному выходу перестраиваемого блока питания с зажимами типа «крокодил», которые входят в комплект питания (рис. 4B). Включите перестраиваемый блок питания и установите его примерно на 2 В, модулируя ручки напряжения и тока на верхнем ряду блока питания. Сразу же обнаженным пальцем пощупайте две поверхности Пельтье. Одна поверхность становится холодной в течение нескольких секунд. Определив, какая поверхность холодная, немедленно отключите питание и отсоедините Пельтье. Используйте маркер, чтобы обозначить холодную поверхность для будущей сборки. 4. Сборка узла для охлаждения Пельтье с помощью узла водяного охлаждения Как показано на рисунке 4А, подготовьте выключенный узел водяного охлаждения, Пельтье (маркировка холодной поверхности) и термопасту (для улучшения теплопроводности). Очистите все поверхности медного блока охлаждения 70% этанолом (или другим более чистящим раствором) в узле водяного охлаждения. Нанесите около 0,4 г термопасты на одну поверхность медного блока водяного охлаждения и убедитесь, что эта ориентация поверхности предотвратит пересечение или изгиб трубок при обращении вниз. Используйте перчатку для защиты кожи и постарайтесь распределить термопасту тонко и равномерно (рис. 4C). Аналогичным образом очистите горячую поверхность Пельтье, затем нанесите термопасту на поверхность (рис. 4D). Соедините горячую поверхность Пельтье с поверхностью медного охлаждающего блока термопастой. Надавите, чтобы убедиться, что он надежно закреплен. Следуйте ориентации проводов на Пельтье и трубок медного блока охлаждения, как показано на рисунке 4E. Очистите излишки термопасты. Не выключайте блок питания 12 В и настраиваемый блок питания. Подключите Пельтье к перестраиваемому источнику питания, как показано в разделе 3. Повторно проверьте соединения узла электрического и водяного охлаждения, а затем последовательно включите блок питания 12 В и перестраиваемый блок питания. Постепенно включайте перестраиваемый блок питания на 12 В. С предложенным Пельтье ток должен быть около 7,3 А. Подождите 2 мин; температура холодной поверхности Пельтье должна стать холоднее -35 °C. Измерьте эту температуру с помощью инфракрасного термометра (рис. 4F). Не прикасайтесь к холодной поверхности, чтобы не поранить руки. Проверьте все соединения и компоненты, если температура не может быть ниже -30 °C. Пузырьки воздуха внутри узла водяного охлаждения являются возможной причиной неоптимальной эффективности охлаждения. Чтобы обеспечить безопасность на последующих этапах, выключите настраиваемый источник питания, подождите 1 минуту, затем выключите источник питания 12 В. 5. Сборка медной пластины и сапфирового окна в сборе Подготовьте медную пластину, сапфировое окно диаметром 80 мм, термопасту, ленту шириной 4 дюйма и острое лезвие для резки (рис. 5A). Тщательно очистите медную пластину и сапфировое окно 70% этанолом и используйте мелкозернистую наждачную бумагу для сглаживания шероховатых поверхностей. Нанесите термопасту на три внутренние поверхности, как показано на рисунке 5B. Убедитесь, что термопаста покрывает все три поверхности поверхности, но не слишком толстая, около 0.5 мм. Положите медную пластину на столешницу, защищенную бумагой для принтера. Бумага облегчает последующую очистку. Вставьте сапфировое окошко в отверстие для медной пластины (рис. 5C). Убедитесь, что сапфир не вращается во время введения, чтобы термопаста не перемещалась в другие области. Удалите излишки термопасты. Приклейте ленту шириной 4 дюйма к верхней поверхности медной пластины-сапфирового окна в сборе (поверхность с квадратной областью углубления, как показано на рисунке 5D). Избегайте пузырьков воздуха между лентой и медными поверхностями во время склеивания, медленно направляя адгезию с одной стороны на другую. Вырежьте указанные синие пунктирные области ленты с помощью острого лезвия, следуя рисунку 5E. Резка обнажает два отверстия для резьбы, квадратное углубление и площадь сапфирового окна диаметром 70 мм. Заклейте скотчем нижнюю поверхность медной пластины-сапфирового окна в сборе, а затем повторите процедуру резки (только в области сапфира) на этой поверхности, как показано на рисунке 5F.ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь сапфировое окно прикреплено к медной пластине, а медные поверхности защищены от ржавчины. 6. Окончательная сборка этапа охлаждения Убедитесь, что все необходимые узлы и компоненты готовы. Нанесите около 0,4 г термопасты на квадратное углубление медной пластины (рис. 6А). Нанесите около 0,4 г термопасты на холодную поверхность Пельтье. Обратите внимание, что Пельтье уже прикреплен к медному блоку охлаждения (рис. 6B). Соедините холодную поверхность Пельтье с углублением медной пластины с давлением вниз. Очистите всю излишки термопасты (рис. 6C). Установите кронштейн, напечатанный на 3D-принтере, в верхней части медного блока охлаждения, а затем с помощью шестигранного ключа затяните два винта длиной 8-32 дюйма 0.5 дюйма, чтобы прикрепить кронштейн к медной пластине (рис. 6D). Используйте затяжку с низким крутящим моментом, чтобы печатный кронштейн не сломался и не деформировался, чтобы обеспечить надлежащую теплопроводность от Пельтье к меди. Поместите медную пластину в изолирующее основание, напечатанное на 3D-принтере, для тепловой изоляции от настольного стола или основания микроскопа во время работы (рис. 6D). Ступень охлаждения собрана и готова к использованию (рис. 6E). Для микроскопии поместите готовый охлаждающий столик на вертикальную платформу микроскопа (рис. 7A). Сборка ступени охлаждения завершена. Более подробную информацию можно найти в сопутствующей публикации Лаборатории Чунга, которая полностью характеризует подробные стратегии и движение животных20. ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах обсуждаются протоколы медленного, быстрого и резкого охлаждения. Гермафродиты N2 в возрасте L4 или в молодом возрасте были использованы для получения следующих данных. Стратегия медленного охлаждения полезна для иммобилизации культивируемых животных N2 при 20 °C при 6 °C; Животные N2, культивируемые при 15 °C, наиболее сильно иммобилизованы при 1 °C20. Краткое сравнение этих трех протоколов охлаждения приведено в таблице 1. 7. Протокол иммобилизации с медленным охлаждением Переместите тарелку для выращивания с крышкой в холодильник с температурой 4 °C. Переместив пластину для выращивания в холодильник, включите питание 12 В на ступени охлаждения и установите перестраиваемое напряжение питания на 5.5 В. После того, как пластина для выращивания с крышкой пробудет в холодильнике с температурой 4 °C в течение 1 часа, немедленно переведите пластину на стадию охлаждения и снимите крышку (рис. 7A). Такие культивационные пластины обычно имеют температуру около 6 ° C. Предварительно охлажденная ступень стабильна и достаточно холодна, чтобы поддерживать поверхность агара при 6 °C. Если температура поверхности агара изменяется, как измерено или отмечено движение животного, слегка отрегулируйте напряжение, пока оно не стабилизируется на уровне 6 °C. Животные должным образом обездвижены в момент передачи. 8. Протокол иммобилизации с быстрым охлаждением ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия быстрого охлаждения является самым основным методом иммобилизации (см. Фильм 1); однако агаровые пластины праздно занимают сцену в течение длительного времени, достигаянабора T. Кроме того, когда требуется сильная иммобилизация иT-установка составляет 6 °C, время простоя увеличивается примерно до 1 часа20 минут. Включите блок питания 12 В охлаждающей сцены и установите перестраиваемое напряжение питания примерно на 12 В. Подождите 10 минут. Поднесите тарелку для выращивания из инкубатора прямо на стадию охлаждения и снимите крышку. Как только температура поверхности агара снизится до (T set + ΔT) °C, отрегулируйте перестраиваемый источник питания вположение V и подождите, пока агар не достигнетT set. Vset – это подходящее напряжение для стабилизации агара приT-образном наборе. ΔT — это переменная, предотвращающая переохлаждение. В таблице 2 приведена комбинациянаборов T, ΔT и V.ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, представленные в таблице 2 , относятся конкретно к лаборатории Чунг, и поэтому следует отметить, что экспериментальные параметры могут варьироваться в зависимости от уникальных условий окружающей среды и использования каждого отдельного эксперимента. Животные обездвиживаются, когда агар достигаетТ-набора. Иммобилизация улучшается со временем до ~50 мин после начала охлаждения. 9. Протокол иммобилизации с резким охлаждением ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия резкого охлаждения отнимает больше всего времени пользователя, но быстрее всего обездвиживает животных от температуры их выращивания. Включите блок питания 12 В ступени охлаждения и поверните перестраиваемое напряжение питания примерно на 12 В. Держать 10 минут. Доведите незанятую тарелку с агаром до стадии охлаждения. Используйте шаг 8.3 в протоколе иммобилизации с быстрым охлаждением, чтобы стабилизировать температуру поверхности агара призаданном T. Переместите животных из исходной тарелки выращивания в охлаждаемую тарелку, находящуюся на стадии охлаждения. В зависимости от размера небольшого животного ожидается, что животные охладятся доT за считанные секунды и будут обездвижены. Иммобилизация улучшается со временем до ~50 мин после начала охлаждения. 10. Оживление животных после охлаждающей иммобилизации Переместите охлажденную культуральную тарелку обратно в исходный инкубатор или при комнатной температуре. Подождите от 20 минут до 1 ч, пока все черви на тарелке не восстановятся к своему нормальному ползанию и кормлению.

Representative Results

Измерение температуры охлажденияДля первоначальных экспериментов по иммобилизации охлаждения важно отслеживать температуру поверхности агара, чтобы убедиться, что животные могут быть должным образом иммобилизованы. Будущие эксперименты, которые повторяются с первоначальных, могут использовать те же параметры, как правило, без частого отслеживания температуры. Для измерения температуры наконечник термопары термометра стерилизуют 70% раствором этанола, ожидая, пока этанол полностью испарится перед использованием. Затем наконечник термопары вставляется на 1 мм в агар NGM, чтобы обеспечить точное считывание температуры. Наконечник термометра удерживается с помощью зажимного держателя или других держателей (рис. 7B). Измерение температуры с помощью инфракрасной камерыСтупень охлаждения предназначена для обеспечения равномерного распределения температуры в центральной области пластины диаметром 40 мм. Инфракрасная камера переднего обзора (FLIR) используется для получения изображения распределения температуры на поверхности агара. Максимальная разница температур составляет около 1 °C, когданабор T равен 1, 3 или 6 °C (рис. 8A). Оценка скорости охлаждения с помощью стратегии быстрого охлажденияСтратегия быстрого охлаждения используется для характеристики скорости охлаждения ступени при 12 В. Пластина 20 °C помещается на ступень охлаждения, а термопарный термометр используется для отслеживания температуры поверхности. Ступень охлаждает пластины с температурой 20 °C до 6 °C за 6 минут, до 1 °C за 10 минут и в конечном итоге стабилизируется ниже -7 °C примерно за 40 минут (рис. 8B). Использование охлаждающего столика на вертикальной платформе микроскопаВертикальный микроскоп обычно включает в себя объектив для визуализации, столик для удержания образца и освещение. Этот охлаждающий столик предназначен для использования на типичном вертикальном столике микроскопа с простой вставкой и извлечением (рис. 8C). Когда для визуализации или скрининга требуется охлаждающая иммобилизация, охлаждающий столик просто помещается на столик микроскопа для завершения установки и наоборот. Иммобилизация червей на охлаждающей пластине показана в фильме 1. Рисунок 1: 3D-модель аппарата ступени охлаждения. Электронные соединения не показаны для наглядности. Бак прокачивает воду через блок охлаждения для отвода тепла, передаваемого Пельтье, встроенным в ступень. Типичная 60-миллиметровая пластина для выращивания полистирола может располагаться на прозрачном сапфировом окне и охлаждаться поэтапно. Модель, созданная в Solidworks. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: 3D-модели компонентов, которые должны быть изготовлены. (А) Медная пластина. (B) Удерживающий кронштейн, напечатанный на 3D-принтере. (C) Изолирующая пластина, напечатанная на 3D-принтере. Модели, созданные в Solidworks. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Узел водяного охлаждения . (А) Отдельные компоненты. Трубы нарезаются на заданную длину. (B) Подключенные компоненты водяного охлаждения. (C) Провода, соединяющие бак насоса и радиатор с источником питания 12 В. Как правило, красные провода подключаются к положительному концу, а черные провода – к отрицательному. (D) Очищенная вода, заливаемая в насос. (E) Резервуар заполнен более чем на две трети для обеспечения оптимальной эффективности насоса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Соединение узла Пельтье и узла водяного охлаждения. (A) Компоненты для работы Пельтье. (B) Использование перестраиваемого источника питания для определения горячей и холодной сторон Пельтье. Для безопасности используется не более 2 В. (C) Равномерное нанесение термопасты на поверхность медного блока. (D) Равномерное нанесение термопасты на горячую поверхность Пельтье. (E) Горячая сторона Пельтье прижимается к медному блоку термопастой. (F) Инфракрасный термометр, используемый для измерения температуры холодной поверхности Пельтье. В идеале холодная температура может достигать около -35 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Сборка медной пластины и сапфирового окна . (A) Необходимые компоненты. (B) Термопаста наносится на три внутренние поверхности медной пластины, где соприкасается сапфировое окно. Два вида медной пластины, обращенные вниз, показывающие расположение трех поверхностей. (C) Сапфировое окно в отверстии медной пластины. (D) Лента, нанесенная на верхнюю поверхность сборки. (E) Верхняя сторона: синие пунктирные линии обозначают места для разрезания и удаления ленты: квадратное углубление, два отверстия и область сапфира диаметром 70 мм. (F) Нижняя сторона: лента разрезается и удаляется, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Окончательная сборка ступени охлаждения . (А) Термопаста наносится на углубление медной пластины. (B) Термопаста, нанесенная на холодную сторону Пельтье. (C) Холодная поверхность Пельтье, соединенная с углублением. (D) Медный блок охлаждения крепится к медной пластине с помощью винтов. Ступень охлаждения в изолирующем основании. е) Завершенная стадия охлаждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Охлаждающий столик на микроскопе и измерение термопары . (A) Охлаждающий столик, размещенный на основании микроскопа для визуализации. Сапфировое окно прозрачное, что позволяет трансиллюминировать. (B) Термопарный термометр, используемый для измерения температуры поверхности агара NGM. Наконечник вставлен примерно на 1 мм в агар NGM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Характеристика и использование ступени охлаждения . (A) Тепловые изображения, показывающие поверхность агара, охлажденную до 1, 3 и 6 °C. Равномерное распределение температуры в центральной области 40 мм (белый пунктирный круг). (B) Температура поверхности агара NGM с течением времени на стадии охлаждения при 12 В. Поверхность агара NGM может быть охлаждена ниже -7 °C. Температуру измеряют по методу, показанному на рисунке 7В. (C) Охлаждающая ступень при использовании на типичном вертикальном микроскопе. Ступень охлаждения легко устанавливается или снимается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. медленное охлаждение Быстрое охлаждение резкое охлаждение Занятие сценой минимум длинный Терпимая время, пока животные не будут обездвижены длинный Терпимая очень короткий Сила иммобилизации сильный Терпимая Терпимая Усилия пользователя минимум чуть больше минимума максимум Таблица 1: Сравнение стратегий охлаждения. T set (°C) ΔT (°C) V-образный комплект (В) 1 2 8 2 3 7.4 3 4.5 7 4 5.5 6.5 5 6 5.9 6 6 5.5 Таблица 2: Параметры для достижения желаемой температуры в стратегии быстрого охлаждения. Дополнительный файл 1: Медная пластина в метрической системе. Чертеж A2D для обработки медной пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Удерживающий кронштейн. 3D-чертеж удерживающего кронштейна, который можно открыть или изменить с помощью Solidworks и экспортировать в программное обеспечение для 3D-печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 3: Изолирующая пластина. 3D-чертеж изолирующей пластины, который можно открыть или изменить с помощью Solidworks и экспортировать в программное обеспечение для 3D-печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Фильм 1: Охлаждение видео. Иммобилизационные черви на агаровой пластине NGM при 2 °C. Пластину охлаждали от комнатной температуры до 2 °С и выдерживали при 2 °С в течение нескольких минут. Затем ступень охлаждения была отключена, и пластины начали прогреваться до комнатной температуры естественным путем. Видео ускоряется в 10 раз, чтобы уместиться в 1-часовое видео за 6 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм. Дополнительная таблица 1: Оценка цены Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Стадия охлаждения, изготовление, сборка и использование показаны в этой рукописи. Большинство компонентов являются готовыми товарами, которые можно приобрести в Интернете. Некоторые компоненты, такие как медная пластина и сапфировое окно, требуют индивидуального заказа и могут занять до 1 месяца. Другие компоненты, которые могут быть напечатаны на 3D-принтере, легко изготавливаются в большинстве научно-исследовательских институтов (дополнительная таблица 1). Процесс сборки требует всего нескольких инструментов и может быть быстро выполнен неспециалистом за несколько часов. Таким образом, большинство биологических лабораторий должны быть в состоянии легко внедрить это устройство.

Стадия охлаждения и подход к охлаждающей иммобилизации обладают несколькими значительными улучшениями по сравнению с существующими методами иммобилизации, подробно описанными в оригинальной публикации²⁰. Короче говоря, стадия охлаждения обеспечивает сильную иммобилизацию больших популяций C. elegans всех возрастов, включая эмбрионы и дауэры, на их типичных культуральных планшетах при стандартных рабочих процессах микроскопии. Это устраняет необходимость в сложных аппаратных настройках, таких как микрофлюидик, обеспечивая при этом более сильный эффект иммобилизации. Кроме того, он сводит к минимуму возможное воздействие токсичных химических веществ на животных и исследователей, поскольку химические вещества не используются, обеспечивая при этом аналогичный эффект иммобилизации. Эти технические возможности позволяют широко применять это устройство и подход ко многим экспериментам, требующим микроскопии in vivo с высоким разрешением на большом количестве животных.

Во время сборки устройства есть несколько важных шагов, в том числе нанесение термопасты и широкая лента для крепления сапфирового окна к медной пластине. Термопаста обеспечивает высокую теплопроводность, заменяя зазоры материалом с низким термическим сопротивлением. Для достижения желаемых характеристик охлаждения пасту необходимо правильно вводить между всеми примыкающими/контактирующими поверхностями, включая холодную поверхность Пельтье на медную пластину, горячую поверхность Пельтье на медный блок охлаждения и медную пластину на сапфировое окно. Широкая лента, нанесенная на ступень, изолирует медную пластину, предотвращая нагрев воздуха и конденсацию, которая приводит к ржавчине. Это также укрепляет связь между сапфировым окном и медной пластиной. Таким образом, как нанесение термопасты, так и широкая лента требуют особой осторожности.

В реальном эксперименте по иммобилизации охлаждения параметры, представленные в этой рукописи, такие как напряжения и время, зависят от конкретных свойств пластин культивирования и стадии, таких как количество агара в пластинах, эффективность стадии, а также температура и влажность окружающей среды. В будущих модификациях может быть установлен контроллер обратной связи, такой как пропорционально-интегральная производная (ПИД), для активной регулировки входного напряжения на ступень охлаждения для достижения желаемой температуры и ее стабилизации.

Существует несколько ограничений этой стадии иммобилизации на стадии охлаждения, подробно описанных в оригинальной публикации²⁰. Короче говоря, животные, выращенные при разных температурах, обездвижены в разной степени, что может потребовать дополнительной тонкой настройки. Кроме того, этот текущий каскад охлаждения не предназначен для инвертированного микроскопа. Кроме того, визуализация или просеивание непосредственно на культивационной пластине может привести к загрязнению пластины.

Мы разрабатываем новые версии охлаждающей ступени, подходящие для различных платформ визуализации, включая составные вертикальные микроскопы и инвертированные микроскопы. Эти новые конструкции позволят напрямую обезвреживать животных на культуральных пластинах во время визуализации на этих платформах. Для визуализации на этих ступенях охлаждения будут использоваться объективы погружения в воздух на большие рабочие расстояния, аналогичные вертикальной конфигурации. В настоящее время воздушные иммерсионные объективы могут иметь числовую апертуру до 0,9, что обеспечивает разрешение около 300 нм для визуализации зеленых флуоресцентных белков. Таким образом, комбинация нового охлаждающего столика с микроскопом может позволить регулярно получать флуоресцентную визуализацию с субмикронным разрешением.

Мы также даем несколько полезных советов по использованию ступени охлаждения в соответствии с нашим опытом. Например, люди должны проверить, нет ли пузырьков воздуха внутри узла водяного охлаждения. Пузырьки воздуха ухудшают охлаждение горячей поверхности Пельтье и, таким образом, снижают эффективность охлаждения ступени охлаждения. Если присутствуют пузырьки воздуха, следует включить источник питания 12 В, чтобы вода текла, и все компоненты потока воды должны быть встряхнуты. Пузырьки воздуха могут вымываться из захваченных областей и вентилироваться через бак насоса. Исследователи должны следить за тем, чтобы трубка потока воды не сгибалась и не пересекалась при сборке узла водяного охлаждения. Изгиб или пересечение труб может препятствовать достаточному потоку воды и снижать эффективность охлаждения. Трубные соединения должны быть правильно подогнаны и плотно залегают. При необходимости вместо нее можно использовать мягкую трубку другого диаметра для обеспечения герметичности. Пасту не следует наносить, даже если соединение недостаточно плотное, так как паста может привести к засорению при использовании в будущем. Влажность в помещении влияет на эффективность охлаждения и приводит к образованию конденсата и льда на ступени охлаждения. Перед размещением культивационной пластины на стадии охлаждения рекомендуется использовать бумажную салфетку для удаления конденсата или использовать радиатор для быстрого удаления льда, образовавшегося на сапфировом окне. Вентиляторы бака насоса и радиатора могут вызывать небольшие вибрации в микроскопе, если они работают на одном столе. Вибрация микроскопа размывает полученное изображение, поэтому ее следует избегать. Для механической изоляции бака и радиатора можно использовать подушку, а можно разместить на отдельном соседнем столе. Ступень охлаждения может стать ступенью нагрева, изменив электрическое соединение с Пельтье.

Materials

12-V power supply	ANYTITI	ledpower00	output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W
8-32 screw	arbitrary		for bracket fixation
bracket	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
breadboard	DEYUE	7545924028	400 pin solderless board kit for DIY electric connection
copper cooling block	Kalolary	Kalolary-Heatsink001	40*40mm internal fin thickness 0.5mm
copper plate	arbitrary	N/A	Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet.  See supplementary for 2D drawing for manufacturing.
digital thermocouple thermometer	Proster	4333090752	dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000°
isolation base	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
jumper wires	arbitrary		for electronic connection
multistage peltier	DigiKey	TEC1-12706	thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V  Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing	ThermoScientific	14-176-332E	ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm
packaging tape	arbitrary		4 inch wide to cover the copper plate
pump tank	Yosoo	SC-300T	input power DC 12V flow rate 300L/h max
radiator	DIYhzWater	10463	12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans
sapphire window	Altos Photonics, Inc.	N/A	Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated
thermal paste	Corsair	XTM50	reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK
tunable power supply	Kungber	DY-SPS3010B	voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads