Detta dokument beskriver protokoll för att konstruera och driva ett kylsteg för att immobilisera C. elegans på sina ursprungliga odlingsplattor i massor.
Högupplösta di vivo-mikroskopimetoder kan avslöja subtil information och fina detaljer inuti modelldjuret Caenorhabditis elegans (C. elegans), men kräver stark djurimmobilisering för att förhindra rörelseoskärpa i bilderna. Tyvärr kräver de flesta nuvarande immobiliseringstekniker betydande manuell ansträngning, vilket gör högupplöst bildbehandling med låg genomströmning. Immobilisering av C. elegans förenklas kraftigt genom att använda en kylningsmetod som lätt kan immobilisera hela populationer direkt på sina odlingsplattor. Kylsteget kan etablera och upprätthålla ett brett temperaturområde med en jämn fördelning på odlingsplattan. I den här artikeln dokumenteras hela processen med att bygga kylsteget. Målet är att en typisk forskare utan svårighet kan bygga ett operativt kylsteg i sitt laboratorium enligt detta protokoll. Användning av kylsteget efter tre protokoll visas, och varje protokoll har fördelar för olika experiment. Dessutom visas ett exempel på en kylprofil för scenen när den närmar sig sin slutliga temperatur och några användbara tips för att använda kylimmobilisering.
Högupplöst optisk mikroskopi ger ett oumbärligt verktyg för att studera biologiska strukturer in vivo på subcellulär nivå. Många biologiska studier kräver avbildning med submikronupplösning för att lösa subtila anatomiska detaljer, inklusive neuronmorfologi 1,2, membranstruktur3,4 och proteinlokalisering 5,6. En högupplöst bild kräver en exponeringstid på flera millisekunder till sekunder, beroende på bildmodalitet och sond 7,8. För att uppnå optimala resultat är det viktigt att noggrant planera och genomföra mikroskopibaserade experiment. Avgörande för detta arbete är en effektiv djurberedningsmetod som underlättar högupplöst bildbehandling.
Nematoden C. elegans är en allmänt använd modellorganism för att studera många biologiska processer9. Detta lilla djur odlas vanligtvis på agarplattor med nematodtillväxtmedium (NGM), och de reproducerar sig snabbt genom självbefruktning, vilket gör dem väl lämpade för storskaliga studier. Deras transparens och ett brett utbud av märkningstekniker möjliggör enkel visualisering av deras inre anatomi10,11. De fina strukturerna i C. elegans är idealiska för att studera biologiska processer på subcellulär nivå, såsom neuronregenerering 12, neurondegeneration13 och celldelning14. Sådana studier kräver avbildning vid submikronupplösning och djurimmobilisering tillräckligt stark för att förhindra bildsuddighet. Stark immobilisering är särskilt avgörande för tekniker som involverar flera bilder i rum eller tid, såsom 3D-bildstaplar (dvs. z-stackar) och time-lapse-avbildning. Alla djurrörelser mellan exponeringarna kan dölja resultatet. För C. elegans innebär stark immobilisering vanligtvis manuell manipulation av enskilda djur och montering av dem på objektglas med bedövningsmedel15,16. Dessa tids- och arbetsintensiva procedurer gör storskaliga experiment mycket svåra. En immobiliseringsstrategi där djur direkt och reversibelt immobiliseras på sina ursprungliga odlingsplattor kan möjliggöra högupplöst avbildning med hög genomströmning.
Kylning immobilisering av C. elegans har visats i några studier men används inte allmänt. Det kombineras vanligtvis med en mikrofluidisk anordning för att ytterligare begränsa djur17,18,19. Mikrofluidiska enheter är emellertid komplexa, kräver betydande operativ utbildning och kan inte enkelt integreras med typiska fasta odlingsarbetsflöden för C. elegans-experiment. Således används mikrofluidik inte i stor utsträckning för C. elegans immobilisering. Presenteras här, i samband med Chung-laboratoriets senaste publikation20, är införandet av en ny kylimmobiliseringsmetod med hjälp av ett termoelektriskt kylsteg (figur 1) för att ta itu med dessa brister. Med kylsteget kan en typisk 60 mm polystyrenodlingsplatta kylas ner till valfri måltemperatur (T-uppsättning) mellan -8 °C till rumstemperatur. Denna kylningsstegsmetod kan enkelt och reversibelt immobilisera en hel djurpopulation med minimal användaransträngning, vilket eliminerar 98% av djurbearbetningstiden20.
Nedan beskrivs procedurerna för att bygga ett kylsteg från början. Med undantag för bearbetning av delar och 3D-utskrift förväntas hela proceduren ta 4 timmar utan krav på specialverktyg eller expertis. Därefter beskrivs ytterligare tre olika kylstrategier med varierande kylhastigheter och användarinsatser för att immobilisera C. elegans på ett typiskt upprätt mikroskop. Vilken strategi som föredras kan bero på användarprogrammet. Protokollen för dessa tre strategier för kylningimmobilisering beskrivs i detalj.
Kylningssteget tillverkning, montering och användning visas i detta manuskript. De flesta komponenterna är färdiga artiklar som kan köpas online. Vissa komponenter, som kopparplattan och safirfönstret, behöver en anpassad beställning och kan ta upp till 1 månad att tillverka. Andra komponenter som kan 3D-printas tillverkas enkelt i de flesta forskningsinstitutioner (kompletterande tabell 1). Monteringsprocessen behöver bara några verktyg och kan snabbt göras av en icke-expert på några timmar. Således bör de flesta biologiska laboratorier enkelt kunna implementera denna enhet.
Kylningssteget och kylningsimmobiliseringsmetoden har flera betydande förbättringar jämfört med befintliga immobiliseringsmetoder, noggrant detaljerade i den ursprungliga publikationen20. I korthet möjliggör kylningssteget en stark immobilisering av stora populationer av C. elegans i alla åldrar, inklusive embryon och dauers, på deras typiska odlingsplattor under standardmikroskopiarbetsflöden. Det eliminerar behovet av komplexa hårdvaruinställningar, som mikrofluidik, samtidigt som det ger en starkare immobiliseringseffekt. Dessutom minimerar det eventuell giftig kemisk exponering för djur och forskare eftersom inga kemikalier används, samtidigt som det ger en liknande immobiliseringseffekt. Dessa tekniska möjligheter möjliggör en bred tillämpning av denna enhet och tillvägagångssätt för många experiment som kräver högupplöst in vivo-mikroskopi på ett stort antal djur.
Det finns några kritiska steg under byggandet av enheten, inklusive all termisk pastaapplikation och den breda tejpen för att fixera safirfönstret på cooperplattan. Den termiska pastan säkerställer stark värmeledningsförmåga genom att ersätta luckor med ett material med låg värmebeständighet. För att uppnå önskad kylprestanda måste pastan föras in ordentligt mellan alla angränsande / kontaktytor, inklusive Peltier kalla ytan till kopparplattan, Peltier heta ytan till kopparkylblocket och kopparplattan till safirfönstret. Den breda tejpen som appliceras på scenen isolerar kopparplattan för att förhindra uppvärmning från luft och kondens, vilket leder till rost. Det stärker också anslutningen mellan safirfönstret och kopparplattan. Således kräver både applicering av termisk pasta och den breda tejpen extra omsorg.
I ett verkligt kylimmobiliseringsexperiment beror parametrarna i detta manuskript, såsom spänningar och tider, på de specifika egenskaperna hos odlingsplattorna och steget, såsom mängden agar i plattorna, scenens effektivitet och omgivningstemperaturen och fuktigheten. I framtida modifieringar kan en återkopplingsregulator installeras, som ett proportionellt integralderivat (PID), för att aktivt justera spänningsingången till kylsteget för att uppnå önskad temperatur och stabilisera den.
Det finns flera begränsningar av denna immobilisering av kylsteget, noggrant detaljerad i originalpublikationen20. Kort sagt, djur som föds upp vid olika temperaturer immobiliseras i olika grad, vilket kan behöva extra finjustering. Dessutom är detta nuvarande kylsteg inte konstruerat för ett inverterat mikroskop. Vidare kan avbildning eller screening på en odlingsplatta direkt införa kontaminering på plattan.
Vi designar nya versioner av kylsteget som är lämpliga för olika bildplattformar, inklusive sammansatta upprättstående mikroskop och inverterade mikroskop. Dessa nya konstruktioner möjliggör direkt immobilisering av djurkylning på odlingsplattor under avbildning på dessa plattformar. Avbildningen på dessa kylsteg kommer att använda långa arbetsavstånd luftnedsänkningsmål, liknande den upprättstående konfigurationen. Numera kan luftsänkningsmål ha en numerisk bländare på upp till 0,9, vilket ger en upplösning på cirka 300 nm för grön fluorescensproteinavbildning. Således kan kombinationen av ett nytt kylsteg med ett mikroskop möjliggöra fluorescensavbildning med submikronupplösning rutinmässigt.
Vi ger också några användbara tips för att använda kylsteget enligt vår erfarenhet. Till exempel bör individer kontrollera om det finns några luftbubblor inuti vattenkylningsaggregatet. Luftbubblor försämrar kylningen till Peltiers heta yta och försämrar därmed kylstegets kyleffektivitet. Om luftbubblor är närvarande ska 12 V-strömförsörjningen slås på för att få vattnet att flöda och alla komponenter i vattenflödet ska skakas. Luftbubblor kan spolas ut från instängda områden och ventileras av pumptanken. Forskare bör se till att vattenflödesröret inte böjs eller korsas vid montering av vattenkylningsaggregatet. Rörböjning eller korsning kan förhindra tillräckligt vattenflöde och minska kyleffektiviteten. Röranslutningarna ska vara ordentligt passande och täta. Vid behov kan ett mjukt rör med en annan diameter användas istället för att säkerställa täthet. Pasta bör inte appliceras, även om anslutningen inte är tillräckligt tät, eftersom pasta kan införa träskor under framtida användning. Luftfuktigheten i rummet påverkar kylprestandan och inför kondens och is i kylsteget. Innan du placerar en odlingsplatta på kylsteget rekommenderas att du använder en pappersvävnad för att ta bort kondens eller använder en kylfläns för att snabbt ta bort is som har bildats på safirfönstret. Pumptanken och radiatorfläktarna kan orsaka små vibrationer i mikroskopet om de arbetar på samma bord. Mikroskopvibrationer suddar ut den förvärvade bilden och bör därför undvikas. En kudde kan användas för att mekaniskt isolera tanken och kylaren, eller de kan placeras på ett separat närliggande bord. Kylsteget kan bli ett uppvärmningssteg genom att vända den elektriska anslutningen till Peltier.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) för kopparplåtbearbetningen.
12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |