Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.
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Articolo metodologico
Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) vengono rilasciate dai neutrofili in risposta a un'infezione batterica o a un danno tissutale traumatico, ma svolgono anche un ruolo nelle malattie autoimmuni e nell'infiammazione sterile. Sono strutture simili a ragnatele composte da filamenti di DNA a doppio filamento, istoni e proteine antimicrobiche. Una volta rilasciati, i NET possono intrappolare e uccidere i patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti. Inoltre, i NET partecipano alla regolazione omeostatica stimolando l'adesione piastrinica e la coagulazione. Tuttavia, la produzione disregolata di NET è stata anche associata a varie malattie, tra cui la sepsi o le malattie autoimmuni, il che li rende un bersaglio promettente per l'intervento terapeutico. Oltre alla microscopia elettronica, la visualizzazione dei NET mediante imaging a immunofluorescenza è attualmente uno dei pochi metodi noti per dimostrare le interazioni NET nei tessuti. Pertanto, sono stati utilizzati vari metodi di colorazione per visualizzare i NET. In letteratura, sono descritti diversi protocolli di colorazione e sono stati identificati quattro componenti chiave che mostrano un'elevata variabilità tra i protocolli: (1) i tipi di anticorpi utilizzati, (2) l'uso di agenti autoriducenti l'autofluorescenza, (3) i metodi di recupero dell'antigene e (4) la permeabilizzazione. Pertanto, i protocolli di colorazione in immunofluorescenza in vitro sono stati sistematicamente adattati e migliorati in questo lavoro per renderli applicabili a diverse specie (topo, uomo) e tessuti (pelle, intestino, polmone, fegato, cuore, disco spinale). Dopo la fissazione e l'inclusione in paraffina, sezioni spesse 3 μm sono state montate su vetrini. Questi campioni sono stati colorati con anticorpi primari per la mieloperossidasi (MPO), l'istone citrullinato H3 (H3cit) e l'elastasi neutrofila (NE) secondo un protocollo di colorazione modificato. I vetrini sono stati colorati con anticorpi secondari ed esaminati utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo. I risultati sono stati analizzati secondo una scheda di valutazione e le differenze sono state registrate in modo semi-quantitativo.
Qui presentiamo un protocollo di colorazione NET ottimizzato adatto a diversi tessuti. Abbiamo utilizzato un nuovo anticorpo primario per colorare H3cit e ridotto la colorazione non specifica con un agente autofluorescente. Inoltre, abbiamo dimostrato che la colorazione NET richiede una temperatura elevata costante e un'attenta manipolazione dei campioni.
Introduzione
Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono state visualizzate per la prima volta da Brinkmann et al. come una via di morte cellulare diversa dall'apoptosi e dalla necrosi nel 20041. In questo percorso, i neutrofili rilasciano la loro cromatina decondensata nello spazio extracellulare per formare grandi strutture simili a ragnatele ricoperte di proteine antimicrobiche che erano precedentemente immagazzinate nei granuli o nel citosol. Queste proteine antimicrobiche includono l'elastasi neutrofila (NE), la mieloperossidasi (MPO) e l'istone citrullinato H3 (H3cit), comunemente usati per la rilevazione in immunofluorescenza indiretta dei N....
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Protocollo
Questo studio ha incluso tessuti di topo derivati da esperimenti approvati dall'Amministrazione statale di Amburgo per la ricerca sugli animali, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Amburgo, Germania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). I tessuti utilizzati erano polmone e colon di topo da un modello settico e pelle ustionata. Abbiamo usato topi maschi e femmine di 8 settimane. Per tutti gli esperimenti è stata seguita la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. I campioni umani anonimizzati includevano tessuti di enterocolite neonatale, pelle ustionata, atresia biliare, spondilodiscite e miocardio. Secondo il....
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Risultati
Prima di iniziare l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo identificato i passaggi chiave per una colorazione di successo cercando su PubMed gli studi che utilizzavano il tessuto FFPE per l'immunocolorazione dei NET e confrontando i loro protocolli. Le differenze di protocollo più promettenti sono state identificate come i passaggi chiave per l'ottimizzazione del protocollo, mentre i passaggi che per lo più corrispondevano tra loro non sono stati modificati (Tabella 1).
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Discussione
In questo lavoro, abbiamo cercato di adattare e ottimizzare i protocolli esistenti per l'imaging dei NET a più tipi di tessuto, a partire dal processo di colorazione vero e proprio. Il primo passo fondamentale per questo metodo è la selezione degli anticorpi più adatti. Per NE, abbiamo provato un anticorpo NE da un ospite di topo su tessuto umano, che non ha mostrato alcuna colorazione affidabile rispetto a NE da un ospite di coniglio. Inoltre, Thålin et al. hanno proposto H3cit (R8) come anticorpo più specifico per la c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata fondata dalla Società di Ricerca Tedesca (BO5534). Ringraziamo Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, la Dott.ssa Annika Heuer e il PD Dr. Ingo Königs per averci fornito i campioni. Inoltre, gli autori ringraziano il team della UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) per il supporto con la microscopia a immunofluorescenza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Diluizione | |||
| Anticorpo anti-elastasi neutrofila 100µ g | abcam | Ab 68672 | s1:100 |
| Anticorpo anti-istone H3 (citrullina R2 + R8 + R17) 100µ g | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anticorpo anti-mieloperossidasi [2C7] anti-umano 100 µ g | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anticorpo anti-mieloperossidasi [2D4] anti-topo 50 µ g | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Software di microscopia Axiovision | Zeiss | 4.8.2. | |
| Soluzione bloccante con siero d'asino (PRONTO ALL'USO) 50ml | GeneTex | ||
| Vetrini coprioggetti | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Soluzione per il recupero del bersaglio Citrato pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| Diluizione degli anticorpi DCS 500 mL | MDS diagnostica | MDS AL120R500 | |
| Formica d'asino capra Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Asino anti coniglio AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Asino anti coniglio Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Montaggio Medio | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Cremagliera per vetrini | Roth | H552.1 | |
| Umano/Topo MPO Anticorpo | R& D Sistemi | AF 3667 | 1:20 |
| Penna idrofobica | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Coniglio IgG Policlonale 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 e 1:250 |
| MaxBlock Kit di reagenti per la riduzione dell'autofluorescenza (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Telecamera per microscopia | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microonde | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 controllo negativo | Dako | X0931 Aglient | 1:50 e 1:5 |
| Normale Controllo IgG di Capra | R& D Sistemi | AB-108-C | s1:100 |
| PBS Soluzione salina tamponata con fosfato (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP barattolo di colorazione | Roth | 2292.2 | |
| Anticorpo ricombinante anti-istone H3 (citrullina R8) 100µ g | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| IgG di coniglio ricombinante, monoclonale [EPR25A] - Isotype Control 200µ g | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus vetrini | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris soluzione salina tamponata (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Bagnomaria | Memmert | 830476 | |
| Cuociriso | a bagnomariareishunger | RCP-30 | |
| Camera umida | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Microscopio a campo largo | Zeiss | Axiovert 200M |
Riferimenti
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
