Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Summary

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l’immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Abstract

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) vengono rilasciate dai neutrofili in risposta a un’infezione batterica o a un danno tissutale traumatico, ma svolgono anche un ruolo nelle malattie autoimmuni e nell’infiammazione sterile. Sono strutture simili a ragnatele composte da filamenti di DNA a doppio filamento, istoni e proteine antimicrobiche. Una volta rilasciati, i NET possono intrappolare e uccidere i patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti. Inoltre, i NET partecipano alla regolazione omeostatica stimolando l’adesione piastrinica e la coagulazione. Tuttavia, la produzione disregolata di NET è stata anche associata a varie malattie, tra cui la sepsi o le malattie autoimmuni, il che li rende un bersaglio promettente per l’intervento terapeutico. Oltre alla microscopia elettronica, la visualizzazione dei NET mediante imaging a immunofluorescenza è attualmente uno dei pochi metodi noti per dimostrare le interazioni NET nei tessuti. Pertanto, sono stati utilizzati vari metodi di colorazione per visualizzare i NET. In letteratura, sono descritti diversi protocolli di colorazione e sono stati identificati quattro componenti chiave che mostrano un’elevata variabilità tra i protocolli: (1) i tipi di anticorpi utilizzati, (2) l’uso di agenti autoriducenti l’autofluorescenza, (3) i metodi di recupero dell’antigene e (4) la permeabilizzazione. Pertanto, i protocolli di colorazione in immunofluorescenza in vitro sono stati sistematicamente adattati e migliorati in questo lavoro per renderli applicabili a diverse specie (topo, uomo) e tessuti (pelle, intestino, polmone, fegato, cuore, disco spinale). Dopo la fissazione e l’inclusione in paraffina, sezioni spesse 3 μm sono state montate su vetrini. Questi campioni sono stati colorati con anticorpi primari per la mieloperossidasi (MPO), l’istone citrullinato H3 (H3cit) e l’elastasi neutrofila (NE) secondo un protocollo di colorazione modificato. I vetrini sono stati colorati con anticorpi secondari ed esaminati utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo. I risultati sono stati analizzati secondo una scheda di valutazione e le differenze sono state registrate in modo semi-quantitativo.

Qui presentiamo un protocollo di colorazione NET ottimizzato adatto a diversi tessuti. Abbiamo utilizzato un nuovo anticorpo primario per colorare H3cit e ridotto la colorazione non specifica con un agente autofluorescente. Inoltre, abbiamo dimostrato che la colorazione NET richiede una temperatura elevata costante e un’attenta manipolazione dei campioni.

Introduction

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono state visualizzate per la prima volta da Brinkmann et al. come una via di morte cellulare diversa dall’apoptosi e dalla necrosi nel 2004¹. In questo percorso, i neutrofili rilasciano la loro cromatina decondensata nello spazio extracellulare per formare grandi strutture simili a ragnatele ricoperte di proteine antimicrobiche che erano precedentemente immagazzinate nei granuli o nel citosol. Queste proteine antimicrobiche includono l’elastasi neutrofila (NE), la mieloperossidasi (MPO) e l’istone citrullinato H3 (H3cit), comunemente usati per la rilevazione in immunofluorescenza indiretta dei NET². Questo metodo non solo identifica la presenza quantitativa di queste proteine; infatti, ha il vantaggio di rilevare in modo specifico strutture simili a NET. Nei NET, le proteine menzionate co-localizzano con il DNA extracellulare, che può essere rilevato da una sovrapposizione dei segnali di fluorescenza di ciascuna proteina colorata e del DNA extracellulare. In contrasto con i segnali sovrapposti dovuti alla co-localizzazione extracellulare di DNA e proteine nei NET, i neutrofili intatti non mostrano alcuna co-localizzazione. In questo caso, i componenti NET sono solitamente immagazzinati separatamente nei granuli, nei nuclei e nel citosol³.

Sin dalla loro prima scoperta, è stato dimostrato che i NET svolgono un ruolo centrale in numerose malattie, in particolare quelle che coinvolgono l’infiammazione. I NET mostrano funzioni antimicrobiche durante l’infezione attraverso l’intrappolamento e l’uccisione di patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti ^4,5. Tuttavia, i NET sono stati anche collegati a malattie autoimmuni e risposte iperinfiammatorie, come il lupus eritematoso sistemico, l’artrite reumatica e l’asma allergica ^6,7,8. I NET promuovono la vaso-occlusione e l’infiammazione nell’aterosclerosi, nell’adesione piastrinica e si ipotizza che svolgano un ruolo nel cancro metastatico 9,10,11. Tuttavia, si ritiene che abbiano proprietà antinfiammatorie riducendo i livelli di citochine proinfiammatorie¹². Mentre i NET stanno guadagnando sempre più interesse in un campo di ricerca più ampio, un solido metodo di rilevamento dei NET è fondamentale per la ricerca futura.

Anche se la visualizzazione dei NET in diversi tessuti mediante imaging a immunofluorescenza è complessa e richiede personalizzazione, a parte la microscopia elettronica, è attualmente uno dei metodi più rinomati per visualizzare le interazioni tra NET e cellule ed è utilizzato prevalentemente nei tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina (FFPE)^13,14. Tuttavia, il confronto tra l’imaging NET è difficile, poiché diversi laboratori utilizzano i propri protocolli personalizzati. Questi protocolli si differenziano per l’uso di anticorpi, il recupero dell’antigene o il metodo di permeabilizzazione e sono spesso ottimizzati per un tipo specifico di tessuto 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Dopo che Brinkmann et al. hanno pubblicato il primo studio metodico che utilizza la visualizzazione immunofluorescente di NET nel tessuto FFPE, abbiamo voluto ottimizzare questo protocollo per una più ampia varietà di tessuti e specie¹⁵. Inoltre, per stabilire un protocollo di immunofluorescenza ampiamente applicabile, abbiamo testato diversi protocolli modificati da studi che utilizzavano metodi di immunofluorescenza nel tessuto FFPE per rilevare i NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Inoltre, abbiamo provato un nuovo anticorpo H3cit per una colorazione extracellulare più specifica²⁸. Ipotizziamo che adattando sistematicamente gli attuali protocolli di colorazione a diverse specie e tessuti, l’imaging in vitro possa essere migliorato, con conseguente migliore rappresentazione dell’interazione tra neutrofili e NET sia a livello locale che sistemico.

Protocol

Questo studio ha incluso tessuti di topo derivati da esperimenti approvati dall’Amministrazione statale di Amburgo per la ricerca sugli animali, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Amburgo, Germania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). I tessuti utilizzati erano polmone e colon di topo da un modello settico e pelle ustionata. Abbiamo usato topi maschi e femmine di 8 settimane. Per tutti gli esperimenti è stata seguita la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientific…

Representative Results

Prima di iniziare l’ottimizzazione del protocollo, abbiamo identificato i passaggi chiave per una colorazione di successo cercando su PubMed gli studi che utilizzavano il tessuto FFPE per l’immunocolorazione dei NET e confrontando i loro protocolli. Le differenze di protocollo più promettenti sono state identificate come i passaggi chiave per l’ottimizzazione del protocollo, mentre i passaggi che per lo più corrispondevano tra loro non sono stati modificati (Tabella 1). <str…

Discussion

In questo lavoro, abbiamo cercato di adattare e ottimizzare i protocolli esistenti per l’imaging dei NET a più tipi di tessuto, a partire dal processo di colorazione vero e proprio. Il primo passo fondamentale per questo metodo è la selezione degli anticorpi più adatti. Per NE, abbiamo provato un anticorpo NE da un ospite di topo su tessuto umano, che non ha mostrato alcuna colorazione affidabile rispetto a NE da un ospite di coniglio. Inoltre, Thålin et al. hanno proposto H3cit (R8) come anticorpo più specifico per…

Materials

			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M