यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस में आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग और संबंधित क्रोमैटिन संशोधनों के एपिजेनेटिक वंशानुक्रम का अध्ययन करने के लिए एक आरएनए हस्तक्षेप और सीएचआईपी परख का वर्णन करता है।
ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक इनहेरिटेंस (टीईआई) गैर-कोडिंग आरएनए और क्रोमैटिन संशोधनों जैसे कारकों के माध्यम से जीनोम अनुक्रम को बदले बिना जर्मलाइन के माध्यम से जानकारी के संचरण की अनुमति देता है। नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) वंशानुक्रम की घटना टीईआई की जांच करने के लिए एक प्रभावी मॉडल है जो इस मॉडल जीव के छोटे जीवन चक्र, आत्म-प्रसार और पारदर्शिता का लाभ उठाता है। आरएनएआई वंशानुक्रम में, आरएनएआई के लिए जानवरों के संपर्क में आने से लक्षित स्थान पर जीन साइलेंसिंग और परिवर्तित क्रोमैटिन हस्ताक्षर होते हैं जो प्रारंभिक ट्रिगर की अनुपस्थिति में कई पीढ़ियों तक बने रहते हैं। यह प्रोटोकॉल जर्मलाइन-व्यक्त परमाणु हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) रिपोर्टर का उपयोग करके सी एलिगेंस में आरएनएआई वंशानुक्रम के विश्लेषण का वर्णन करता है। जीएफपी को लक्षित करने वाले डबल-फंसे आरएनए को व्यक्त करने वाले जानवरों के बैक्टीरिया को खिलाकर रिपोर्टर साइलेंसिंग शुरू की जाती है। प्रत्येक पीढ़ी में, जानवरों को सिंक्रनाइज़ विकास को बनाए रखने के लिए पारित किया जाता है, और रिपोर्टर जीन साइलेंसिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है। चुनिंदा पीढ़ियों में, आबादी को जीएफपी रिपोर्टर लोकस में हिस्टोन संशोधन संवर्धन को मापने के लिए क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) -मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) के लिए एकत्र और संसाधित किया जाता है। आरएनएआई वंशानुक्रम का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और छोटे आरएनए और क्रोमैटिन मार्गों में टीईआई कारकों की जांच करने के लिए अन्य विश्लेषणों के साथ जोड़ा जा सकता है।
एपिजेनेटिक वंशानुक्रम पीढ़ियों में जीन नियामक जानकारी के संचरण की अनुमति देता है और इसलिए माता-पिता के पर्यावरण या अनुभवों को उनकी संतान को प्रभावित करने की अनुमति दे सकता है। एलिगेंस में, बहिर्जात डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) द्वारा शुरू की गई जर्मलाइन जीन साइलेंसिंग को संतान में कई पीढ़ियों के लिए विरासत में मिला जा सकता है जो मूल ट्रिगर 1,2,3,4 के संपर्क में नहीं आता है। यह प्रक्रिया, जिसे आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) वंशानुक्रम कहा जाता है, सी एलिगेंस में कई संबंधित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग घटनाओं में से एक है, जिसमें पिआरएनए-शुरू किए गए मल्टीजेनरेशनल साइलेंसिंग2,5, पैराम्यूटेशन / आरएनएई (आरएनए-प्रेरित एपिजेनेटिक साइलेंसिंग) 6,7,8, और मल्टीकॉपी सरणी-शुरू साइलेंसिंग9 शामिल हैं, जिनमें छोटे आरएनए और क्रोमैटिन विनियमन मशीनरी के लिए अतिव्यापी लेकिन अलग-अलग आवश्यकताएं हैं।. एलिगेंस एक्सोजेनस आरएनएआई में, डीएसआरएनए को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) में संसाधित किया जाता है जो अपने लक्ष्य एमआरएनए को पहचानने के लिए प्राथमिक आर्गोनॉट प्रोटीन के साथ एक परिसर में कार्य करते हैं। यह लक्ष्यीकरण द्वितीयक एसआईआरएनए के प्रवर्धन की ओर जाता है जो साइटोप्लाज्मिक और परमाणु साइलेंसिंग मार्गों दोनों के माध्यम से एमआरएनए को शांत करने के लिए द्वितीयक आर्गोनॉट्स के साथ जुड़ते हैं। जर्मलाइन-व्यक्त आरएनएआई लक्ष्यों के लिए, परमाणु द्वितीयक आर्गोनॉट एचआरडीई -1 और अतिरिक्त परमाणु आरएनएआई कारक नवजात प्रतिलेख को लक्षित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसक्रिप्शनल दमन और हिस्टोन मिथाइलट्रांसफेरेज़ की भर्ती दमनकारी क्रोमैटिन निशान जमा करने के लिए होती है, जिसमें एच 3 के 9 एम 310 शामिल है। हिस्टोन H3K9me3 RNAI वंशानुक्रम11,12 द्वारा जर्मलाइन-व्यक्त ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) ट्रांसजेन के आनुवंशिक साइलेंसिंग की स्थापना को बढ़ावा देता है।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आरएनएआई वंशानुक्रम के लिए एक रिपोर्टर के रूप में जर्मलाइन में जीएफपी-हिस्टोन फ्यूजन प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेन का उपयोग करना है और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (सीएचआईपी-क्यूपीसीआर) का उपयोग करके रिपोर्टर ट्रांसजेन लोकस में हिस्टोन संशोधनों में परिवर्तन की परख करना है। यह प्रोटोकॉल रिपोर्टर साइलेंसिंग शुरू करने के लिए एक मानकीकृत प्लेट-आधारित आरएनएआई फीडिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है। यह क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार (‘ब्लीचिंग’) द्वारा गर्भवती वयस्कों से गर्भाशय भ्रूण में अलग करके पीढ़ियों के बीच जानवरों को पारित करने के लिए एक विस्तृत समयरेखा भी प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा आबादी के उप-समूह में जीएफपी साइलेंसिंग की आवृत्ति की निगरानी के लिए तरीके और प्रतिनिधि डेटा और हिस्टोन एच 3 के 9 एम 3 सीएचआईपी-क्यूपीसीआर के लिए भी वर्णित हैं। रिपोर्टर-आधारित आरएनएआई वंशानुक्रम परख एपिजेनेटिक विनियमन 13,14 में आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की भूमिकाओं को कार्यात्मक रूप से विच्छेदित करने के लिए एक अत्यधिक साध्य प्रणाली प्रदान करते हैं, और ऐसे संवाददाताओं का उपयोग करके आनुवंशिक स्क्रीन ने दोनों जीनों की पहचान की है जो 2,3,15 के लिए आवश्यक हैं और जीन जो 16,17 ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक वंशानुक्रम की अवधि को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, डीएसआरएनए को खिलाकर पेश किया जाता है, जो सी एलिगेंस18 में एक मानक विधि बन गया है। आरएनएआई वंशानुक्रम परख के लिए, भोजन दृष्टिकोण 2,11,12,22,23,24,25 की बड़ी पी 0 आबादी प्राप्त करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है। हालांकि, आरएनएआई एक्सपोजर का समय और अवधि ट्रांसजेन साइलेंसिंग26 की प्रभावकारिता को प्रभावित करती है, और आरएनएआई बैक्टीरिया की एकाग्रता हेरिटेबल आरएनएआई साइलेंसिंग1 की दृढ़ता को प्रभावित करती है। इसलिए, मानकीकृत आरएनएआई बैक्टीरिया और कृमि वृद्धि जीएफपी साइलेंसिंग और वंशानुक्रम की अवधि के एक सुसंगत स्तर को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहां, भ्रूण को आरएनएआई प्लेटों पर चढ़ाया जाता है ताकि पी 0 जानवर सेने से आरएनएआई बैक्टीरिया के संपर्क में आ सकें। वैकल्पिक तरीकों ने आरएनएआई-एनजीएम प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ किए गए एल 1 24,27 या एल 425 चरण जानवरों को चढ़ाया है। इसके अलावा, चूंकि भुखमरी और अन्य तनाव आरएनएआई वंशानुक्रम13 के रखरखाव को प्रभावित करते हैं, इसलिए खाद्य आपूर्ति की भीड़भाड़ और थकावट को रोकने के लिए प्लेटों की निगरानी की जानी चाहिए। भोजन द्वारा आरएनएआई शुरू करने के विकल्प के रूप में, कुछ अग्रणी सी एलिगेंस आरएनएआई वंशानुक्रम अध्ययनों ने गोनैड इंजेक्शन के माध्यम से आरएनएआई को प्रेरित किया, जो डीएसआरएनए एकाग्रता 1,28 का अधिक नियंत्रण प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल में, प्रत्येक पीढ़ी को क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार के साथ आबादी के रूप में पारित किया जाता है, जैसा कि पहले वर्णित 16,22,23,24 था। हाइपोक्लोराइट उपचार यह सुनिश्चित करता है कि एफ 1 पीढ़ी माता-पिताके वातावरण से आरएनएआई बैक्टीरिया से दूषित नहीं होगी और संभावित अवांछित आबादी की बोतल-गर्दन को रोकती है। हालांकि, थोक पासिंग भी एक सीमा हो सकती है, क्योंकि व्यक्तिगत जानवरों में अलग-अलग वंशानुक्रम पैटर्न 1,29 हो सकते हैं। प्रत्येक पीढ़ी को स्थापित करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका 1,2,9,11,25 व्यक्तिगत जानवरों का चयन करना है। यह दृष्टिकोण वंशावली के भीतर फेनोटाइप्स को ट्रैक करने और आनुवंशिक क्रॉस के समावेश की अनुमति देता है। वंश विश्लेषण कम पेनेट्रेंस फेनोटाइप12 के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति आरएनएआई-प्रेरित साइलेंसिंग 2,3,4,12,14,15,16,25,30 का एक शक्तिशाली और सुविधाजनक रीडआउट है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, जीएफपी अभिव्यक्ति को मैन्युअल रूप से ऑन या ऑफ 11,12,15,16,25 के रूप में स्कोर किया जा सकता है। गुणात्मक तीव्रता स्तर 3,4,14 निर्दिष्ट करके मैनुअल स्कोरिंग को और परिष्कृत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, माइक्रोस्कोपी छवियों 11,12,14,25,27 की स्वचालित तीव्रता स्कोरिंग या जीवित जानवरों के फ्लो साइटोमेट्री फ्लोरेसेंस माप 2 एक मात्रात्मक और उच्च-थ्रूपुट रीडआउट प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, चूंकि रिपोर्टर अभिव्यक्ति जर्मलाइन तक ही सीमित है, इसलिए स्वचालित दृष्टिकोणों की एक चेतावनी यह है कि उन्हें खामोश जीएफपी अभिव्यक्ति वाले जानवरों बनाम बिना जर्मलाइन वाले जानवरों के बीच भी अंतर करना चाहिए, खासकर अगर अध्ययन में असामान्य जर्मलाइन विकास वाले उत्परिवर्ती शामिल हैं। जीएफपी प्रतिदीप्ति के विकल्प के रूप में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी)-क्यूपीसीआर का उपयोग आरएनएआई लक्ष्य प्री-एमआरएनए और एमआरएनए स्तर 2,16,23,24 को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण साइलेंसिंग का अधिक प्रत्यक्ष रीडआउट प्रदान करता है, जो आरएनए को लक्षित करता है, और विशेष रूप से अन्य आरएनएआई लक्ष्यों के लिए उपयोगी है जहां साइलेंसिंग एक दृश्यमान फेनोटाइप का उत्पादन नहीं करता है। कृत्रिम जीएफपी संवाददाताओं का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि बहिर्जात और अंतर्जात अनुक्रम ों को ट्रांसजेनरेशनल आरएनएआई11 में अलग-अलग विनियमित किया जाता है। अंतर्जात लक्ष्यों के साथ अध्ययन, जैसे कि तापमान-संवेदनशील भ्रूण घातक एलील ओमा -1 (zu405)1,11,16,25, इसलिए फ्लोरोसेंट ट्रांसजेन संवाददाताओं के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में माना जाना चाहिए।
आरएनएआई वंशानुक्रम परख के संदर्भ में सीएचआईपी के विश्लेषण के लिए उपचार और प्रतिकृति के बीच तुलना की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, नमूनों के बीच प्रारंभिक सामग्री में अंतर के लिए, सीएचआईपी सिग्नल को ‘इनपुट के प्रतिशत’ के समान स्थान पर इनपुट सिग्नल के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। समानांतर में हिस्टोन एच 3 सीएचआईपी को संसाधित करने से यह निर्धारित करने में मदद मिलेगी कि क्या कोई हिस्टोन संशोधन परिवर्तन न्यूक्लियोसोम घनत्व में परिवर्तन के अनुरूप है। इसके अलावा, क्योंकि CHIP एक बहु-चरण प्रक्रिया है, दक्षता नमूनों के बीच भिन्न हो सकती है। उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण लोकी का चयन नमूने और प्रयोगों के बीच सिग्नल-टू-शोर अनुपात का मूल्यांकन और तुलना करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, नमूनों के बीच तुलना की सुविधा के लिए, आरएनएआई लक्ष्य पर सीएचआईपी डीएनए क्यूपीसीआर थ्रेशोल्ड चक्र मान अक्सर 3,11,15,23,30,31 के नियंत्रण स्थान तक सामान्यीकृत होते हैं। आरएनएआई उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, उपचार आरएनएआई बनाम नियंत्रण या कोई आरएनएआई स्थितियों में सीएचआईपी सिग्नल के अनुपात की भी तुलना की जाती है। वर्तमान दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि सीएचआईपी पूरे जानवरों के साथ किया जाता है, जबकि आरएनएआई उपचार की प्रतिक्रिया जर्मलाइन के लिए अद्वितीय हो सकती है। इस चेतावनी को दूर करने का एक तरीका पृथक जर्मलाइन नाभिक का उपयोग करके सीएचआईपी करना है। CHIP को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त तकनीकी विचारों पर भी कहीं और बड़े पैमाने पर चर्चा की गईहै।
कुल मिलाकर, यह आरएनएआई वंशानुक्रम और सीएचआईपी प्रोटोकॉल एक विस्तृत और आसानी से अनुकूलन नींव प्रदान करता है जिसे ट्रांसजेनरेशनल एपिजेनेटिक विनियमन का पता लगाने के लिए अन्य तकनीकों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण पुस्तकालयों का निर्माण सीएचआईपी डीएनए (सीएचआईपी-सेक) से आरएनएआई लक्ष्य के समीपस्थ और जीनोम-व्यापक पैमाने पर क्रोमैटिन परिदृश्य के अधिक विस्तृत दृश्य के लिए किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
एलिगेंस समुदाय में प्रयोगशालाओं को स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने उपकरणों को विकसित और साझा किया और जिनके काम को इस पांडुलिपि में उद्धृत किया गया है। कुछ उपभेदों को सीजीसी द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। इस काम को एएलएस (पीजेटी -175245) को कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर) परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सीएल कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (पीजीएस-डी) द्वारा समर्थित है।
Agarose | Bioshop | AGA002 | |
Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 – 1 mg/mL). |
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 – 1 mg/mL). |
Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
Plasmid – Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
Plasmid – GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
RNase A | Sigma | R4642 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |