Detta protokoll beskriver en RNA-interferens och ChIP-analys för att studera det epigenetiska nedärvningen av RNAi-inducerad avstängning och associerade kromatinmodifieringar i C. elegans.
Transgenerationell epigenetisk nedärvning (TEI) möjliggör överföring av information genom könscellerna utan att ändra genomsekvensen, genom faktorer som icke-kodande RNA och kromatinmodifieringar. Fenomenet RNA-interferens (RNAi) nedärvning i rundmasken Caenorhabditis elegans är en effektiv modell för att undersöka TEI som drar nytta av denna modellorganisms korta livscykel, självförökning och transparens. Vid RNAi-nedärvning leder exponering av djur för RNAi till nedtystning av gener och förändrade kromatinsignaturer på målplatsen som kvarstår i flera generationer i frånvaro av den initiala utlösaren. Detta protokoll beskriver analysen av RNAi-arv i C. elegans med hjälp av en germline-uttryckt nukleärt grönt fluorescerande protein (GFP) reporter. Rapportörens nedtystning initieras genom att djuren matas med bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA som riktar sig mot GFP. Vid varje generation passerar djuren för att upprätthålla en synkroniserad utveckling, och nedtystning av reportergenerna bestäms genom mikroskopi. Vid utvalda generationer samlas populationer in och bearbetas för kromatinimmunoprecipitering (ChIP)-kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för att mäta anrikning av histonmodifiering vid GFP-reporterplatsen. Detta protokoll för att studera RNAi-arv kan enkelt modifieras och kombineras med andra analyser för att ytterligare undersöka TEI-faktorer i små RNA- och kromatinvägar.
Epigenetisk nedärvning möjliggör överföring av genreglerande information mellan generationer och kan därför göra det möjligt för föräldrarnas miljö eller erfarenheter att påverka deras avkomma. I C. elegans kan nedtystning av könsceller initierad av exogent dubbelsträngat RNA (dsRNA) nedärvas i flera generationer i avkomman som inte exponerats för den ursprungliga triggern 1,2,3,4. Denna process, som kallas RNA-interferens (RNAi) nedärvning, är ett av flera relaterade epigenetiska avstängningsfenomen i C. elegans, inklusive piRNA-initierad flergenerationsavstängning2,5, paramutation/RNAe (RNA-inducerad epigenetisk avstängning)6,7,8 och multicopy array-initierad avstängning9, som har överlappande men distinkta krav på små RNA- och kromatinregleringsmaskiner . I C. elegans exogena RNAi bearbetas dsRNA till små interfererande RNA (siRNA) som verkar i ett komplex med primära Argonaute-proteiner för att känna igen sitt mål-mRNA. Denna målinriktning leder till förstärkning av sekundära siRNA som associeras med sekundära Argonautes för att tysta mål-mRNA genom både cytoplasmatiska och nukleära avstängningsvägar. För könscellsuttryckta RNAi-mål riktar sig den nukleära sekundära Argonaute HRDE-1 och ytterligare nukleära RNAi-faktorer mot begynnande transkript, vilket resulterar i transkriptionell repression och rekrytering av histonmetyltransferaser för att deponera repressiva kromatinmärken, inklusive H3K9me310. Histone H3K9me3 främjar etableringen av ärftlig avstängning av könscellsuttryckta gröna fluorescerande proteintransgener (GFP) genom RNAi-arv11,12.
Målet med detta protokoll är att använda en transgen som uttrycker ett GFP-histonfusionsprotein i könscellen som en rapportör för RNAi-arv och att analysera förändringar i histonmodifieringar vid reportertransgenlokus med hjälp av kromatinimmunprecipitering och kvantitativ polymeraskedjereaktion (ChIP-qPCR). Detta protokoll beskriver en standardiserad plattbaserad RNAi-matningsmetod för att initiera nedtystning av rapportörer. Den innehåller också en detaljerad tidsplan för hur djur ska kunna överföras mellan generationer genom att embryon från dräktiga vuxna isoleras i livmodern genom alkalisk hypokloritbehandling (“blekning”). Metoder och representativa data för övervakning av frekvensen av GFP-avstängning i en undergrupp av befolkningen genom fluorescensmikroskopi och för histon H3K9me3 ChIP-qPCR beskrivs också. Reporterbaserade RNAi-arvsanalyser ger ett mycket lätthanterligt system för att funktionellt dissekera rollerna av genetiska och miljömässiga faktorer i epigenetisk reglering 13,14, och genetiska skärmar med hjälp av sådana rapportörer har identifierat både gener som krävs för 2,3,15 och gener som negativt reglerar16,17 varaktigheten av transgenerationell epigenetisk nedärvning.
I detta protokoll introduceras dsRNA genom utfodring, vilket har blivit en standardmetod i C. elegans18. För RNAi-nedärvningsanalyser ger utfodringsmetoden en enkel metod för att erhålla en stor P0-population 2,11,12,22,23,24,25. Tidpunkten och varaktigheten av RNAi-exponeringen påverkar dock effekten av transgen nedtystning26, och koncentrationen av RNAi-bakterier påverkar varaktigheten av ärftlig RNAi-avstängning1. Därför är standardiserade RNAi-bakterier och masktillväxt viktiga för att få en konsekvent nivå av GFP-avstängning och nedärvningstid. Här pläteras embryon på RNAi-plattor så att P0-djuren exponeras för RNAi-bakterier från kläckningen. Alternativa metoder har pläterat synkroniserade L1 24,27 ellerL4 25 djur på RNAi-NGM-plattor. Dessutom, eftersom svält och andra påfrestningar påverkar upprätthållandet av RNAi-arv13, måste plattorna övervakas för att förhindra överbeläggning och utmattning av matförrådet. Som ett alternativ till att initiera RNAi genom utfodring inducerade några av pionjärstudierna av C. elegans RNAi RNAi genom gonadinjektion, vilket ger en större kontroll av dsRNA-koncentrationen 1,28.
I detta protokoll passerar varje generation som en population med alkalisk hypokloritbehandling, som tidigare beskrivits 16,22,23,24. Hypokloritbehandling säkerställer att F1-generationen inte kommer att kontamineras med RNAi-bakterier från föräldramiljön22 och förhindrar potentiell oönskad flaskhals i populationen. Bulkförflyttning kan dock också vara en begränsning, eftersom enskilda djur kan ha distinkta nedärvningsmönster 1,29. En alternativ metod för att fastställa varje generation är att välja ut enskilda djur 1,2,9,11,25. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att spåra fenotyper inom linjer och införliva genetiska korsningar. Härstamningsanalys kan också vara fördelaktigt för fenotyper med låg penetrans12.
Fluorescerande proteinuttryck är en kraftfull och bekväm avläsning av RNAi-inducerad avstängning 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Som beskrivs i detta protokoll kan GFP-uttryck manuellt poängsättas som PÅ eller AV 11,12,15,16,25. Manuell poängsättning kan förfinas ytterligare genom att tilldela kvalitativa intensitetsnivåer 3,4,14. Alternativt kan automatiserad intensitetsbedömning av mikroskopibilder 11,12,14,25,27 eller flödescytometrifluorescensmätning av levande djur2 ge en kvantitativ avläsning med hög genomströmning. Men eftersom reporteruttrycket är begränsat till könscellerna är en invändning mot automatiserade metoder att de också måste skilja mellan djur med tystat GFP-uttryck och djur utan könsceller, särskilt om studien innehåller mutanter med onormal könscellsutveckling. Som ett alternativ till GFP-fluorescens kan omvänd transkription (RT)-qPCR användas för att kvantifiera RNAi-målpre-mRNA och mRNA-nivåer 2,16,23,24. Detta tillvägagångssätt ger en mer direkt avläsning av avstängning, som riktar sig mot RNA, och är särskilt användbart för andra RNAi-mål där avstängning inte ger en synlig fenotyp. En begränsning med att använda artificiella GFP-rapportörer är att exogena och endogena sekvenser är differentiellt reglerade i transgenerationellt RNAi11. Studier med endogena mål, såsom den temperaturkänsliga embryonala letala allelen OMA-1(zu405)1,11,16,25, bör därför betraktas som ett komplement till fluorescerande transgenrapportörer.
Analysen av ChIP i samband med RNAi-arvsanalyser kräver jämförelse mellan behandlingar och replikat. För det första, för att ta hänsyn till skillnader i utgångsmaterial mellan samplingar, normaliseras ChIP-signalen till insignal på samma plats som “procentandelen av ingången”. Parallell bearbetning av en histon H3 ChIP hjälper till att avgöra om några histonmodifieringsförändringar motsvarar förändringar i nukleosomtätheten. Dessutom, eftersom ChIP är en process i flera steg, kan effektiviteten variera mellan prover. Valet av lämpliga positiva och negativa kontrollplatser är användbart för att utvärdera och jämföra signal-brusförhållandet mellan prover och experiment. Dessutom, för att underlätta jämförelser mellan prover, normaliseras ofta ChIP DNA qPCR-tröskelcykelvärdena vid RNAi-målet till ett kontrolllokus 3,11,15,23,30,31. För att utvärdera effekterna av RNAi-behandlingen jämförs också förhållandet mellan ChIP-signalen i behandlings-RNAi kontra kontroll- eller inga RNAi-förhållanden. En begränsning med det nuvarande tillvägagångssättet är att ChIP utförs med hela djur, medan svaret på RNAi-behandling kan vara unikt för könscellerna. Ett tillvägagångssätt för att övervinna denna varning är att utföra ChIP med hjälp av isolerade könsceller. Ytterligare tekniska överväganden för att optimera ChIP har också diskuterats utförligt på andra håll32,33.
Sammantaget ger detta RNAi-arv och ChIP-protokoll en detaljerad och lättanpassad grund som kan integreras med andra tekniker för att ytterligare utforska transgenerationell epigenetisk reglering. Till exempel kan sekvenseringsbibliotek med hög genomströmning konstrueras från ChIP-DNA (ChIP-seq) för en mer detaljerad bild av kromatinlandskapet både proximalt till RNAi-målet och på en genomomfattande skala.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka laboratorierna i C. elegans-gemenskapen som utvecklade och delade verktygen och vars arbete citeras i detta manuskript. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Detta arbete stöddes av ett projektbidrag från Canadian Institutes of Health Research (CIHR) till A.L.S. (PJT-175245). CL stöds av ett forskarstipendium från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (PGS-D).
Agarose | Bioshop | AGA002 | |
Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 – 1 mg/mL). |
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 – 1 mg/mL). |
Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
Plasmid – Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
Plasmid – GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
RNase A | Sigma | R4642 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |