使用基于电穿孔的质粒DNA递送对 体内 脑肿瘤进行建模，以代表患者突变特征
Summary
利用由常见患者突变驱动的免疫功能正常的本土肿瘤模型进行临床前测试对于免疫治疗测试至关重要。该协议描述了一种使用基于电穿孔的质粒DNA递送生成脑肿瘤小鼠模型的方法，这些质粒DNA代表常见的患者突变，从而提供准确，可重复和一致的小鼠模型。
Abstract
肿瘤模型对于脑肿瘤的临床前测试至关重要，因为它可以探索新的、更有效的治疗方法。随着人们对免疫疗法的浓厚兴趣，拥有一致的、临床相关的、免疫功能正常的小鼠模型来检查大脑中的肿瘤和免疫细胞群及其对治疗的反应就显得尤为重要。虽然大多数临床前模型利用已建立的肿瘤细胞系的原位移植，但这里介绍的建模系统允许从 插入体内分裂神经前体细胞 （NPC） 的 DNA 构建体中逐步而有效地开发患者特异性肿瘤突变的“个性化”表示。DNA 构建体采用双重组酶介导的盒式交换 （MADR） 方法进行嵌合分析，可实现驱动突变的单拷贝体细胞诱变。使用出生至3天大的新生小鼠幼崽，通过利用侧脑室内衬的这些分裂细胞来靶向NPC。将 DNA 质粒（例如，MADR 衍生的转座子、CRISPR 定向的 sgRNA）显微注射到心室中，然后使用围绕头部喙部区域的桨进行电穿孔。在电刺激下，DNA被吸收到分裂细胞中，并有可能整合到基因组中。这种方法的使用已成功用于发展儿童和成人脑肿瘤，包括最常见的恶性脑肿瘤胶质母细胞瘤。本文讨论并演示了使用该技术开发脑肿瘤模型的不同步骤，包括麻醉年轻小鼠幼崽的过程，到质粒混合物的显微注射，然后进行电穿孔。有了这种自主的、免疫功能正常的小鼠模型，研究人员将有能力扩展临床前建模方法，以努力改进和检查有效的癌症治疗。
Introduction
小鼠脑肿瘤模型对于理解脑肿瘤形成和治疗的机制至关重要。目前的模型通常包括基于有限数量的驱动突变或患者来源的异种移植模型，使用阻碍适当免疫治疗研究的免疫缺陷小鼠对常用肿瘤细胞系进行快速产生的皮下或原位移植 1,2,3,4。此外，这些临床前结果可能导致假阳性，因为此类模型可以表现出对治疗反应的戏剧性，通常是治愈效果，但这并不能转化为临床 2,5,6,7。能够快速生成更能反映患者突变特征的基因工程临床前小鼠模型对于提高临床前结果的有效性至关重要。
基于电穿孔 （EP） 的 DNA 质粒递送可诱导功能丧失 （LOF） 和功能获得 （GOF） 突变，从而可以生成此类模型。我们开发了一种更精确地表示 GOF 驱动突变的方法，称为双重组酶介导的盒交换或 MADR8 的镶嵌分析。该方法允许在体细胞中以受控的、位点特异性的方式表达感兴趣的基因（或多个基因）8。结合其他分子工具，如成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR），可以将不同的患者突变结合起来，开发小鼠脑肿瘤模型。该方法已用于不同的小儿脑肿瘤，包括胶质瘤和室管膜瘤8，以及成人脑肿瘤模型，例如胶质母细胞瘤 （GBM）。
虽然肿瘤建模的EP方法不像移植那样普遍，但以下证明了迄今为止该建模系统的易用性和高可重复性。mTmG小鼠用于插入MADR质粒DNA 8,9。该系统允许位于 Rosa26 位点的 loxP 和 Flp 重组酶靶标 （FRT） 位点进行重组，以便随后插入供体 DNA 质粒（即目的基因 GOF）8,9。以下方案证明了该方法在勤奋实践后的简单性，以及以自主，一致的方式开发小鼠脑肿瘤模型的能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
基于电穿孔的质粒DNA递送允许在体内使用分子生物学，类似于基因工程小鼠模型中使用的分子生物学，但具有病毒转导的速度、定位和效率8,13,14。然而，后者带来了安全问题和免疫反应。我们在使用质粒 DNA 的 EP 递送的建模系统中表明，由于最初将玻璃毛细管移液管插入脑室8，因此发生了最小的免疫?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Gi Bum Kim的免疫荧光染色和图像。我们还要感谢 Emily Hatanaka、Naomi Kobritz 和 Paul Linesch 对协议的有用建议。
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
Riferimenti
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
