מידול גידולי מוח in vivo באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצג חתימות מוטציה של מטופל
Summary
שימוש במודל גידול אוטוכתוני חיסוני המונע על ידי מוטציות נפוצות של חולים לבדיקות פרה-קליניות הוא קריטי לבדיקות אימונותרפיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של עכברי גידול במוח באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצגים מוטציות נפוצות של חולים, ובכך מספקים מודל עכבר מדויק, ניתן לשחזור ועקבי.
Abstract
מודלים של גידולים הם קריטיים לבדיקה פרה-קלינית של גידולי מוח במונחים של בחינת טיפולים חדשים ויעילים יותר. עם עניין משמעותי באימונותרפיה, חיוני עוד יותר שיהיה מודל עקבי, רלוונטי קלינית וכשיר חיסון של עכברים כדי לבחון את אוכלוסיות הגידול ותאי החיסון במוח ואת תגובתם לטיפול. בעוד שרוב המודלים הפרה-קליניים משתמשים בהשתלה אורתוטופית של קווי תאי גידול מבוססים, מערכת המידול המוצגת כאן מאפשרת ייצוג “מותאם אישית” של מוטציות גידוליות ספציפיות למטופל בהתפתחות הדרגתית אך יעילה ממבני DNA המוחדרים לתאים מבשרי עצבים מתחלקים (NPCs) in vivo. מבני דנ”א כוללים את ניתוח הפסיפס בשיטת MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), המאפשרת מוטגנזה סומטית של מוטציות מניעות בעותק יחיד. באמצעות גורי עכברים שזה עתה נולדו בין הלידה לגיל 3 ימים, NPCs ממוקדים על ידי ניצול התאים המתחלקים האלה המצפים את החדרים הצדיים. מיקרו-הזרקה של פלסמידים של DNA (למשל, MADR-derived, טרנספוזונים, sgRNA מכוון קריספר) לתוך החדרים מלווה אלקטרופורציה באמצעות משוטים המקיפים את האזור הרוסטרלי של הראש. לאחר גירוי חשמלי, הדנ”א נקלט לתוך התאים המתחלקים, עם פוטנציאל להשתלב בגנום. השימוש בשיטה זו הוכח בהצלחה בפיתוח גידולי מוח הן בילדים והן במבוגרים, כולל גידול המוח הממאיר הנפוץ ביותר, גליובלסטומה. מאמר זה דן ומדגים את השלבים השונים של פיתוח מודל גידול במוח באמצעות טכניקה זו, כולל הליך של הרדמת גורי עכברים צעירים, למיקרו-הזרקה של תערובת הפלסמיד, ולאחר מכן אלקטרופורציה. באמצעות מודל עכבר אוטוכתוני וחיסוני זה, לחוקרים תהיה היכולת להרחיב גישות מודלים פרה-קליניים, במאמצים לשפר ולבחון טיפול יעיל בסרטן.
Introduction
מודלים של גידולי מוח הם חיוניים להבנת המנגנונים של היווצרות גידולי מוח וטיפול בהם. המודלים הנוכחיים כוללים בדרך כלל השתלות תת-עוריות או אורתוטופיות המיוצרות במהירות של קווי תאים סרטניים נפוצים, בהתבסס על מספר מוגבל של מוטציות מניעות או מודלים של xenograft שמקורם בחולה, תוך שימוש בעכברים מדוכאי חיסון המעכבים מחקרי אימונותרפיה תקינים 1,2,3,4. בנוסף, תוצאות פרה-קליניות אלה יכולות להוביל לתוצאות חיוביות שגויות, בכך שמודלים כאלה יכולים להציג השפעות דרמטיות, לעתים קרובות מרפאות, בתגובה לטיפול, אך זה לא מתורגם למרפאה 2,5,6,7. היכולת לייצר במהירות מודלים פרה-קליניים של עכברים מהונדסים גנטית המשקפים יותר את חתימות המוטציות של המטופל היא הכרחית לשיפור תוקפן של תוצאות פרה-קליניות.
העברה מבוססת אלקטרופורציה (EP) של פלסמידים של DNA כדי לגרום הן למוטציות אובדן תפקוד (LOF) והן למוטציות רווח תפקוד (GOF) מאפשרת יצירת מודלים כאלה. פיתחנו שיטה לייצוג מדויק עוד יותר של מוטציות דרייבר GOF הנקראת ניתוח פסיפס עם החלפת קלטות בתיווך רקומבינאז כפול, או MADR8. שיטה זו מאפשרת ביטוי של גן (או גנים) בעלי עניין באופן מבוקר וספציפי ללוקוס בתאים סומטיים8. בשילוב עם כלים מולקולריים אחרים, כגון Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ניתן לשלב מוטציות שונות של חולים כדי לפתח מודלים של גידולי מוח בעכבר. שיטה זו שימשה לגידולי מוח שונים בילדים, כולל גליומות ואפנדימומה8, כמו גם מודלים של גידולי מוח במבוגרים, כגון גליובלסטומה (GBM).
בעוד ששיטת EP של מידול גידולים אינה נפוצה כמו השתלה, הדברים הבאים מדגימים עד כה את הקלות והשכפול הגבוה של מערכת מידול זו. עכברי mTmG משמשים להחדרת DNA MADR-פלסמיד 8,9. מערכת זו מאפשרת רקומבינציה של אתרי יעד loxP ו- Flp recombinase (FRT) הממוקמים במוקד Rosa26 להחדרה עוקבת של פלסמיד ה- DNA התורם (כלומר, גן GOF של עניין)8,9. הפרוטוקול הבא מדגים את הפשטות של שיטה זו לאחר תרגול קפדני, ואת היכולת לפתח מודלים של גידולי מוח בעכבר באופן אוטוכתוני ועקבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד מאפשרת שימוש in vivo בביולוגיה מולקולרית, בדומה לזו המשמשת במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, אך עם המהירות, הלוקליזציה והיעילות של התמרה ויראלית 8,13,14. עם זאת, עם האחרון מגיעים חששות בטיחות, כמו גם ת?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג’י בום קים על הצביעה האימונופלואורסצנטית והתמונות. אנו מודים גם לאמילי הטנאקה, נעמי קובריץ ופול לינש על העצות המועילות לגבי הפרוטוקול.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
Riferimenti
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
