Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente
Summary
La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.
Abstract
Los modelos tumorales son fundamentales para las pruebas preclínicas de los tumores cerebrales en términos de explorar tratamientos nuevos y más eficaces. Con un interés significativo en la inmunoterapia, es aún más importante contar con un modelo de ratón consistente, clínicamente pertinente e inmunocompetente para examinar las poblaciones de tumores y células inmunitarias en el cerebro y su respuesta al tratamiento. Si bien la mayoría de los modelos preclínicos utilizan el trasplante ortotópico de líneas celulares tumorales establecidas, el sistema de modelado presentado aquí permite una representación “personalizada” de las mutaciones tumorales específicas del paciente en un desarrollo gradual pero efectivo a partir de construcciones de ADN insertadas en células precursoras neurales (NPC) en división in vivo. Las construcciones de ADN presentan el análisis en mosaico con el método de intercambio de casetes mediado por recombinasa dual (MADR), lo que permite la mutagénesis somática de una sola copia de las mutaciones conductoras. Utilizando crías de ratón recién nacidas entre el nacimiento y los 3 días de edad, los NPC son atacados aprovechando estas células en división que recubren los ventrículos laterales. La microinyección de plásmidos de ADN (p. ej., derivados de MADR, transposones, sgRNA dirigido por CRISPR) en los ventrículos es seguida de electroporación utilizando paletas que rodean la región rostral de la cabeza. Tras la estimulación eléctrica, el ADN es absorbido por las células en división, con el potencial de integrarse en el genoma. El uso de este método se ha demostrado con éxito en el desarrollo de tumores cerebrales pediátricos y adultos, incluido el tumor cerebral maligno más común, el glioblastoma. Este artículo discute y demuestra los diferentes pasos del desarrollo de un modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluyendo el procedimiento de anestesia de crías de ratón jóvenes, hasta la microinyección de la mezcla de plásmidos, seguida de electroporación. Con este modelo de ratón autóctono e inmunocompetente, los investigadores tendrán la capacidad de ampliar los enfoques de modelado preclínico, en un esfuerzo por mejorar y examinar el tratamiento eficaz del cáncer.
Introduction
Los modelos de tumores cerebrales murinos son cruciales para comprender los mecanismos de formación y tratamiento de tumores cerebrales. Los modelos actuales suelen incluir trasplantes subcutáneos u ortotópicos producidos rápidamente de líneas celulares tumorales de uso común, basados en un número limitado de mutaciones conductoras o modelos de xenoinjertos derivados de pacientes, utilizando ratones inmunodeficientes que dificultan los estudios de inmunoterapia adecuados 1,2,3,4. Además, estos resultados preclínicos pueden conducir a falsos positivos, en el sentido de que dichos modelos pueden exhibir efectos dramáticos, a menudo curativos, en respuesta a la terapia, pero esto no se traduce en la clínica 2,5,6,7. Tener la capacidad de producir rápidamente modelos de ratón preclínicos modificados genéticamente que reflejen mejor las firmas de mutación de los pacientes es imperativo para mejorar la validez de los resultados preclínicos.
La administración de plásmidos de ADN basada en la electroporación (EP) para inducir mutaciones tanto de pérdida de función (LOF) como de ganancia de función (GOF) permite la generación de dichos modelos. Desarrollamos un método para una representación aún más precisa de las mutaciones conductoras de GOF llamado análisis en mosaico con intercambio de casetes mediado por doble recombinasa, o MADR8. Este método permite la expresión de un gen (o genes) de interés de forma controlada y específica del locus en células somáticas8. En combinación con otras herramientas moleculares, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), se pueden combinar diferentes mutaciones de pacientes para desarrollar modelos de tumores cerebrales de ratón. Este método se ha utilizado para diferentes tumores cerebrales pediátricos, incluidos gliomas y ependimomas8, así como modelos de tumores cerebrales en adultos, como el glioblastoma (GBM).
Si bien el método EP de modelado tumoral no es tan común como un trasplante, lo siguiente demuestra hasta ahora la facilidad y la alta reproducibilidad de este sistema de modelado. Los ratones mTmG se utilizan para la inserción del ADN plasmídico MADR 8,9. Este sistema permite la recombinación de los sitios diana loxP y Flp recombinasa (FRT) localizados en el locus Rosa26 para la posterior inserción del plásmido de ADN donante (es decir, el gen GOF de interés)8,9. El siguiente protocolo demuestra la sencillez de este método después de una práctica diligente y la capacidad de desarrollar modelos de tumores cerebrales de ratón de una manera autóctona y consistente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La administración de ADN plasmídico basada en la electroporación permite el uso in vivo de la biología molecular, similar a la utilizada en modelos de ratón modificados genéticamente, pero con la velocidad, localización y eficiencia de la transducción viral 8,13,14. Con esto último, sin embargo, vienen preocupaciones de seguridad, así como respuestas inmunitarias. Hemos demostrado en nuestro sistema de modelad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Gi Bum Kim por la tinción inmunofluorescente y las imágenes. También agradecemos a Emily Hatanaka, Naomi Kobritz y Paul Linesch por sus útiles consejos sobre el protocolo.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
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