يظهر هنا بروتوكول فعال لنضح الدم السريع لإعداد عينات الأنسجة من الضفادع الأفريقية ذات المخالب لدراسات النسخ والبروتينات.
كانت Xenopus كائنات نموذجية قوية لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من 100 عام. هنا ، يتم تعريف بروتوكول نضح الدم السريع في Xenopus ، والذي يهدف إلى انخفاض ثابت وجذري للدم داخل جميع الأنسجة. يتم إجراء التروية عن طريق إدخال إبرة مباشرة في بطين القلب وضخ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر نظام الأوعية الدموية. يمكن إكمال الإجراء في حوالي 10 دقائق لكل. يهيمن على الدم عدد قليل من البروتينات وأنواع الخلايا الوفيرة للغاية ، مما يخلق العديد من المشكلات لأن هذه البروتينات تخفي معظم الجزيئات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. سيستفيد التوصيف القابل للتكرار لأنسجة Xenopus البالغة مع البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية من تطبيق هذا البروتوكول قبل أخذ عينات الأعضاء. يتم تعريف بروتوكولات أخذ عينات الأنسجة في الأوراق المصاحبة. تهدف هذه الإجراءات إلى توحيد الممارسات عبر Xenopus من مختلف الجنس والعمر والحالة الصحية ، وتحديدا X. laevis و X. tropicalis.
يتم الانتهاء من نضح البرمائيات بالكامل بشكل روتيني لأغراض الحفظ والتثبيت1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، تحدث هذه الإجراءات بمعدل يحد من عدد العينات الطازجة التي يمكن أخذها لكل. الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول فعال لنضح الدم في Xenopus ، مع إعطاء الأولوية لسرعة هذه التقنية. يستغرق البروتوكول أقل من 10 دقائق لكل ل X. tropicalis وأقل من 15 دقيقة لكل X. laevis. الأولويات الثانوية هي سهولة النسخ واستخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة بحيث يمكن مشاركة العينات عالية الجودة على نطاق واسع بين مختبرات Xenopus.
تستخدم ضفادع Xenopus على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لدراسة العمليات البيولوجية والمرضية الأساسية المحفوظة عبر الأنواع. هذا رباعي الأرجل له علاقة تطورية أوثق مع الثدييات من النماذج المائية الأخرى ، حيث يحتوي على رئتين وقلب من ثلاث غرف وأطراف ذات أرقام. يستخدم المجتمع الدولي Xenopus بشكل فعال لاكتساب فهم أعمق للأمراض البشرية من خلال نمذجة الأمراض المتعمقة والتحليل الجزيئي لوظيفة الجينات المرتبطة بالمرض. المزايا العديدة ل Xenopus كنموذج حيواني تجعلها أدوات لا تقدر بثمن لدراسة الأساس الجزيئي للتنمية البشرية والمرض. وتشمل هذه المزايا: حجم البويضة والجنين الكبير ، والخصوبة العالية ، وسهولة السكن ، والتطور الخارجي السريع ، وسهولة التلاعب الجينومي. تشير التقديرات إلى أن Xenopus يشارك ~ 80٪ من جينات الأمراض البشرية المحددة7.
بالمقارنة مع نماذج الثدييات الشائعة ، يعد Xenopus نموذجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة ، مع سهولة هدم المورفولينو وتوافر الجينات المحورة الفعالة والطفرات الجينية المستهدفة باستخدام CRISPR8. تم تطبيق قياس الطيف الكتلي الكمي والنسخ أحادي الخلية بنجاح على أجنة Xenopus 9,10 ، لكن أطلس الخلايا الأخير من Xenopus laevis يظهر أن تكوين معظم الأنسجة تهيمن عليه أنواع خلايا الدم 11. من خلال تطوير تقنية تقوم بإخراج الأنسجة بمعدل سريع واستخدام الوسائط المبردة ، تتأثر نضارة العينة إلى الحد الأدنى بالتروية. هذا مهم بشكل خاص للتطبيقات التي يكون الهدف فيها هو تحديد mRNA غير المضطرب من الناحية الفسيولوجية أو تعبير البروتين.
يصف هذا البروتوكول تقنيات التشريح التقليدية للوصول إلى تجويف coelomic. التقنيات الأخرى مقبولة أيضا ، بشرط أن تسبب الحد الأدنى من الضرر للأنسجة ، ويمكن الوصول إلى القلب ، وتكون الرئة والمعدة مرئية. وبالمثل ، يمكن استبدال معظم أدوات التشريح المدرجة بسهولة بعناصر قابلة للمقارنة.
…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة OD R24 التابعة للمعاهد الوطنية للصحة OD031956 ومنحة NICHD R01 HD073104. نشكر دارسي كيلي على المناقشات المفيدة والمدخلات الأولية حول هذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر سامانثا جالبرت وجيل رالستون وويل راتزان على مساعدتهم ودعمهم بالإضافة إلى المراجعين النظراء الثلاثة المجهولين على ملاحظاتهم.
5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |