En forbedret teknikk for trimetylamin deteksjon i dyreavledet medisin ved headspace gasskromatografi-tandem quadrupole massespektrometri
Summary
Her beskrives en headspace gasskromatografi-tandem kvadrupol massespektrometri (HS-GC-MS/MS) metode egnet for bestemmelse av trimetylamin (TMA) i legemidler fra dyr. Protokollen inkluderer prøveforbehandling, headspace-behandling, analysebetingelser, metodologisk validering og bestemmelse av TMA i legemidler avledet fra dyr.
Abstract
Animalske avledede medisiner har særegne egenskaper og signifikante kurative effekter, men de fleste av dem har en åpenbar fiskeaktig lukt, noe som resulterer i dårlig etterlevelse av kliniske pasienter. Trimetylamin (TMA) er en av de viktigste fiskeluktkomponentene i animalsk avledet medisin. Det er vanskelig å identifisere TMA nøyaktig ved hjelp av den eksisterende deteksjonsmetoden på grunn av det økte trykket i headspace-hetteglasset forårsaket av den raske syrebasereaksjonen etter tilsetning av lut, noe som får TMA til å rømme fra headspace-hetteglasset, og stopper forskningsfremgangen til fiskelukten av animalsk avledet medisin. I denne studien foreslo vi en kontrollert deteksjonsmetode som introduserte et parafinlag som et isolasjonslag mellom syre og lut. Hastigheten på TMA-produksjonen kan effektivt kontrolleres ved langsomt å gjøre parafinlaget flytende gjennom termostatovnoppvarming. Denne metoden viste tilfredsstillende linearitet, presisjonseksperimenter og gjenoppretting med god reproduserbarhet og høy sensitivitet. Det ga teknisk støtte til deodorisering av animalsk avledet medisin.
Introduction
Behandling av menneskelige sykdommer ved å benytte produkter avledet fra animalske deler og / eller deres biprodukter (referert til her som animalske avledede medisiner) får økt oppmerksomhet. De spiller en viktig rolle i behandling av kreft, kardiovaskulær sykdom, levercirrhose, mastitt og andre sykdommer, med fordelene med sterk effekt, liten dosering og signifikant og spesifikk klinisk effekt. Imidlertid har dyreavledede medisiner generelt en fremtredende fiskelukt, noe som i stor grad påvirker pasientens etterlevelse, og er spesielt ugunstige for barn 1,2. Fiskelukten kommer hovedsakelig fra proteiner, aminosyrer, fett og andre stoffer som finnes i medisinen, som brytes ned gjennom fettsyreoksidasjon, nedbrytning av aminosyrer og andre måter å produsere en rekke stoffer med en fiskeaktig lukt 2,3,4. Blant dem er trimetylamin (TMA) en flyktig gass med en fiskeaktig lukt som er utbredt i råtnende eller råtne animalske matvarer5.
Hittil har gasskromatografi (GC), væskekromatografi (LC), ionekromatografi, spektrofotometri, væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) og sensormetoder ofte blitt brukt til å oppdage TMA i miljøet, mat og urin 6,7,8,9. På grunn av den lave kontamineringen av GC-kolonnen og injeksjonssystemet, samt den høye følsomheten, reproduserbarheten og den lave deteksjonsgrensen (0,1-1 mg/kg), ble headspace-gasskromatografi-massespektrometri-metoden (HS-GC-MS) foretrukket for mat og biologisk analyse8. For tiden er det bare Kina som har etablert en nasjonal standard for TMA i mat, og HS-GC-MS er den første metoden i GB5009.179-2016-standarden10. Derfor ble ovennevnte HS-GC-MS-metode valgt for å oppdage TMA i animalsk avledet medisin. I det tidlige stadiet fant vår forskningsgruppe at HS-GC-MS-deteksjonsstandarden for TMA i mat kunne oppdage fiskelukt i flere animalske avledede medisiner. Kombinert med resultatene fra studiene11,12, kan det bevises at TMA er det vanlige nøkkelstoffet i fiskelukt i animalske avledede medisiner. Imidlertid ble det funnet at reproduserbarheten av de eksperimentelle resultatene var dårlig, og det var problemer som TMA-flukt og dårlig stabilitet, som ikke kunne verifiseres av metodikken. Dette kan skyldes at luten ble injisert i hetteglasset med headspace, og den raske syrebasereaksjonen førte til økt trykk i hetteglasset, og dermed slapp TMA ut av injeksjonsporen, noe som forhindret stabil og nøyaktig påvisning av TMA. Derfor foreslo denne studien en forbedret headspace gasskromatografi-tandem quadrupole massespektrometri (HS-GC-MS / MS) deteksjonsmetode for å løse disse problemene.
Protokollen forbedrer prøveforbehandlingen ved å separere syrebasereaktantene i forbehandlingen ved hjelp av fast parafin, et godt fast-væske faseendringsmateriale. Da parafinen langsomt ble flytende med temperaturstigningen i den termostatiske ovnen, ble TMA også sakte frigjort i hetteglasset med forseglet headspace, noe som unngikk trykkøkningen forårsaket av den voldsomme og raske syrebasereaksjonen og sikret stabil og nøyaktig TMA-deteksjon. Videre undertrykte headspace-injeksjonen kombinert med flere reaksjonsovervåkingsmoduser (MRM) i GC-MS/MS effektivt matrikskjemisk interferens og sikret påliteligheten av resultatene. Resultatene av den metodiske valideringen viste at linearitet, presisjonstest og utvinningsgrad av den forbedrede deteksjonsmetoden kunne oppfylle kravene, med god reproduserbarhet og høy følsomhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Animalske legemidler kommer fra hele kroppen, organer eller vev, fysiologiske eller patologiske produkter, utskillelser eller sekresjoner og bearbeidede produkter fra dyr. TMA er en viktig kilde til fiskelukt i dyreavledede medisiner; Det er et typisk illeluktende stoff med en svært lav olfaktorisk terskel (0,000032 × 10-6 V / V) og en sterk fiskelukt13. For tiden kan den vanlige HS-GC-MS-metoden ikke oppdage TMA i dyreavledede medisiner stabilt og nøyaktig.
<p class="jove_conten…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82173991), og Sichuan Science and Technology Program (2022YFS0442).
Materials
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
Riferimenti
- Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
- Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
- Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
- Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
- Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
- Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
- Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
- Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
- Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
- National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
- Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
- Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
- Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
- Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).
