Porfyrinmodificerede perler til brug som kompensationskontrol i flowcytometri
Summary
Protokollen beskriver, hvordan porfyrinbaserede kompensationsperler til flowcytometri fremstilles ved reaktionen af aminfunktionaliserede polystyrenperler med porfyrin-TCPP og amidkoblingsreagenset EDC. En filtreringsprocedure anvendes til at reducere partikelbiprodukterne.
Abstract
Flowcytometri kan hurtigt karakterisere og kvantificere forskellige cellepopulationer baseret på fluorescensmålinger. Cellerne farves først med et eller flere fluorescerende reagenser, der hver funktionaliseres med et andet fluorescerende molekyle (fluorofor), der binder selektivt til celler baseret på deres fænotypiske egenskaber, såsom celleoverfladeantigenekspression. Intensiteten af fluorescens fra hvert reagens bundet til celler kan måles på flowcytometeret ved hjælp af kanaler, der detekterer et specificeret bølgelængdeområde. Når der anvendes flere fluoroforer, spildes lyset fra individuelle fluoroforer ofte over i uønskede detektionskanaler, hvilket kræver en korrektion af fluorescensintensitetsdataene i en proces kaldet kompensation.
Kompensationskontrolpartikler, typisk polymerperler bundet til en enkelt fluorofor, er nødvendige for hver fluorofor, der anvendes i et cellemærkningseksperiment. Data fra kompensationspartikler fra flowcytometeret bruges til at anvende en korrektion på fluorescensintensitetsmålingerne. Denne protokol beskriver fremstilling og oprensning af polystyrenkompensationsperler, der er kovalent funktionaliseret med det fluorescerende reagens meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphin (TCPP) og deres anvendelse i flowcytometrikompensation. I dette arbejde blev aminfunktionaliserede polystyrenperler behandlet med TCPP og amidkoblingsreagenset EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid) ved pH 6 og ved stuetemperatur i 16 timer med omrøring. TCPP-perlerne blev isoleret ved centrifugering og resuspenderet i en pH 7-buffer til opbevaring. TCPP-relaterede partikler blev observeret som et biprodukt. Antallet af disse partikler kan reduceres ved hjælp af en valgfri filtreringsprotokol. De resulterende TCPP-perler blev med succes anvendt på et flowcytometer til kompensation i eksperimenter med humane sputumbeller mærket med flere fluoroforer. TCPP-perlerne viste sig stabile efter opbevaring i køleskab i 300 dage.
Introduction
Porfyriner har været af interesse i mange år på det biomedicinske område på grund af deres fluorescens og tumormålretningsegenskaber 1,2,3. Terapeutiske anvendelser såsom fotodynamisk terapi (PDT) og sonodynamisk terapi (SDT) indebærer systemisk administration af et porfyrin til en kræftpatient, akkumulering af lægemidlet i tumoren og den lokaliserede eksponering af tumoren for et laserlys med en bestemt bølgelængde eller ultralyd. Eksponeringen for laserlys eller ultralyd fører til porfyrinets dannelse af reaktive iltarter og efterfølgende celledød 4,5. Ved fotodynamisk diagnose (PDD) anvendes porfyrinfluorescens til at skelne kræftceller fra normale celler6. I denne sammenhæng anvendes protoporphyrin IX, et naturligt fluorescerende porfyrin, der akkumuleres i tumorer ved systemisk eller lokal injektion af dets forløber, 5-aminolevulinsyre (5-ALA), til at identificere gastrointestinale stromale tumorer, blærekræft og hjernekræft 7,8. For nylig blev 5-ALA behandling undersøgt som en tilgang til at detektere minimal resterende sygdom i myelomatose9. Vores laboratorium har brugt tetraaryl porfyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphin) for dets evne til selektivt at plette lungekræftceller og kræftassocierede celler i humane sputumprøver, hvilket er en egenskab, der er blevet udnyttet i diasbaserede og flow cytometriske diagnostiske assays10.
Nogle porfyriner er bifunktionelle, idet de kan anvendes som terapeutiske og diagnostiske midler 2,11. I biomedicinsk forskning anvendes sådanne bifunktionelle porfyriner til at evaluere, hvordan deres evne til selektivt at målrette og dræbe kræftceller er en funktion af deres struktur, samt hvordan den påvirkes af tilstedeværelsen af andre forbindelser 12,13,14,15,16. Både den cellulære optagelse af porfyriner og deres cytotoksicitet kan måles på en flowcytometrisk platform på en høj gennemstrømningsmåde. Absorptions- og emissionsspektrene for fluorescerende porfyriner er komplekse, men de fleste flowcytometriske platforme er udstyret til korrekt at identificere dem. Absorptionsspektret af fluorescerende porfyriner er kendetegnet ved et stærkt absorptionsbånd i området 380-500 nm, kendt som Soret-båndet. To til fire svagere absorptionsbånd observeres generelt i området 500-750 nm (Q-bånd)17. En blå 488 nm laser, der findes i de fleste flowcytometre, eller en violet laser (405 nm) kan generere lys med den passende bølgelængde for at excitere porfyriner. Emissionsspektrene for porfyriner viser typisk toppe i området 600-800 nm18, hvilket resulterer i meget lidt spektral overlapning med fluoresceinisothiocyanat eller phycoerythrin (PE) fluoroforer, men betydelig overlapning med andre ofte anvendte fluoroforer, såsom allophycocyanin (APC), såvel som tandemfluoroforer, såsom PE-Cy5 og andre. Når der anvendes porfyriner i flerfarvede flowcytometriassays, er enkeltfluoroforkontroller derfor afgørende for tilstrækkeligt at korrigere afsmitningen af fluorescens i andre kanaler end den, der er udpeget til at måle porfyrinens fluorescens.
Ideelt set bør de enkeltfluoroforkontroller, der anvendes til beregning af spillovermatrixen for et panel af fluoroforer (også kaldet “kompensationskontrol”), bestå af samme celletype(r) som prøven. Det er imidlertid ikke optimalt at bruge prøven til dette formål, hvis der er meget lidt prøve til at begynde med, eller hvis målgruppen i prøven er meget lille (for eksempel hvis man ønsker at se på minimal restsygdom eller kræftceller i de tidlige stadier af sygdommen). Et nyttigt alternativ til celler er perler kombineret med den samme fluorofor, der bruges til at analysere prøven. Mange sådanne perler er kommercielt tilgængelige; Disse perler er enten formærket med den ønskede fluorofor (formærkede fluoroforspecifikke perler)19,20, eller et fluorescerende mærket antistof kan fastgøres til dem (antistofindfangningsperler)20,21. Mens kommercielle kompensationsperler er tilgængelige for mange fluoroforer, er sådanne perler ikke tilgængelige for porfyriner på trods af deres stigende anvendelse i grundlæggende og klinisk forskning.
Ud over prøvekonservering og positive versus negative populationer af passende størrelse er de andre fordele ved at bruge perler som kompensationskontrol den lette forberedelse, lav baggrundsfluorescens og fremragende stabilitet over tid22. Den potentielle ulempe ved at bruge perler som kompensationskontrol er, at emissionsspektret for det fluorescerende antistof, der er fanget på perler, kan afvige fra det samme antistof, der bruges til at mærke cellerne. Dette kan være af særlig betydning, når der anvendes et spektralflowcytometer20. Derfor skal udviklingen af perler som kompensationskontrol udføres på flowcytometeret, der vil blive brugt til det assay, som perlerne udvikles til. Desuden skal udviklingen af perlerne omfatte en sammenligning med celler mærket med det samme fluorescerende farvningsreagens.
Her beskriver vi fremstillingen af TCPP-aminfunktionaliserede polystyrenkompensationsperler, hvis medianfluorescensintensitet i detektionskanalen var sammenlignelig med TCPP-mærkede celler i sputum, og deres anvendelse som kompensationskontroller for flowcytometri. Autofluorescensen af ækvivalente, ikke-funktionaliserede perler var tilstrækkelig lav til deres anvendelse som negativ fluorescenskompensationskontrol. Derudover viste disse perler stabilitet i opbevaring i næsten 1 år.
Protocol
Representative Results
Discussion
På trods af de mange anvendelser af porfyriner i kræftdiagnose og terapi2 er der begrænset litteratur om deres potentielle anvendelse som et flowcytometrisk reagens til identifikation af kræftcellepopulationer versus ikke-kræftcellepopulationer i primært humant væv24,25,26. Vores forskning i flowcytometrisk analyse af humant sputum24,27 kr?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke David Rodriguez for hjælp med figurforberedelsen og Precision Pathology Services (San Antonio, TX) for brugen af dets Navios EX flowcytometer.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Riferimenti
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chimica. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochimica. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
