Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Summary

Het protocol beschrijft hoe op porfyrine gebaseerde compensatieparels voor flowcytometrie worden bereid door de reactie van amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels met de porfyrine TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC. Een filtratieprocedure wordt gebruikt om de deeltjesbijproducten te verminderen.

Abstract

Flowcytometrie kan snel diverse celpopulaties karakteriseren en kwantificeren op basis van fluorescentiemetingen. De cellen worden eerst gekleurd met een of meer fluorescerende reagentia, elk gefunctionaliseerd met een ander fluorescerend molecuul (fluorofoor) dat selectief aan cellen bindt op basis van hun fenotypische kenmerken, zoals antigeenexpressie van het celoppervlak. De intensiteit van fluorescentie van elk reagens gebonden aan cellen kan worden gemeten op de flowcytometer met behulp van kanalen die een bepaald golflengtebereik detecteren. Wanneer meerdere fluoroforen worden gebruikt, loopt het licht van individuele fluoroforen vaak over in ongewenste detectiekanalen, wat een correctie van de fluorescentie-intensiteitsgegevens vereist in een proces dat compensatie wordt genoemd.

Compensatiecontroledeeltjes, meestal polymeerparels gebonden aan een enkele fluorofoor, zijn nodig voor elke fluorofoor die wordt gebruikt in een celetiketteringsexperiment. Gegevens van compensatiedeeltjes van de flowcytometer worden gebruikt om een correctie toe te passen op de fluorescentie-intensiteitsmetingen. Dit protocol beschrijft de bereiding en zuivering van polystyreencompensatieparels covalent gefunctionaliseerd met het fluorescerende reagens meso-tetra(4-carboxyfenyl) porfine (TCPP) en hun toepassing in flowcytometriecompensatie. In dit werk werden amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels behandeld met TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride) bij pH 6 en bij kamertemperatuur gedurende 16 uur met roeren. De TCPP-kralen werden geïsoleerd door centrifugeren en geresuspendeerd in een pH 7-buffer voor opslag. TCPP-gerelateerde deeltjes werden waargenomen als bijproduct. Het aantal van deze deeltjes kan worden verminderd met behulp van een optioneel filtratieprotocol. De resulterende TCPP-kralen werden met succes gebruikt op een flowcytometer voor compensatie in experimenten met menselijke sputumcellen gelabeld met meerdere fluoroforen. De TCPP-kralen bleken stabiel na 300 dagen bewaren in een koelkast.

Introduction

Porfyrines zijn al vele jaren van belang op biomedisch gebied vanwege hun fluorescentie en tumorgerichte eigenschappen ^1,2,3. Therapeutische toepassingen zoals fotodynamische therapie (PDT) en sonodynamische therapie (SDT) omvatten de systemische toediening van een porfyrine aan een kankerpatiënt, de accumulatie van het geneesmiddel in de tumor en de gelokaliseerde blootstelling van de tumor aan een laserlicht van een specifieke golflengte of echografie. De blootstelling aan laserlicht of echografie leidt tot het genereren van reactieve zuurstofsoorten door de porfyrine en de daaropvolgende celdood ^4,5. Bij fotodynamische diagnose (PDD) wordt porfyrinefluorescentie gebruikt om kankercellen te onderscheiden van normale cellen⁶. In deze context wordt protoporfyrine IX, een natuurlijke fluorescerende porfyrine die zich ophoopt in tumoren bij de systemische of lokale injectie van zijn voorloper, 5-aminolevulinezuur (5-ALA), gebruikt om gastro-intestinale stromale tumoren, blaaskanker en hersenkanker^{te identificeren 7,8}. Meer recent werd 5-ALA-behandeling onderzocht als een benadering om minimale restziekte bij multipel myeloom te detecteren⁹. Ons laboratorium heeft de tetraarylporfyrine TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyfenyl)-21,23 H-porfine) gebruikt vanwege zijn vermogen om longkankercellen en kankergeassocieerde cellen selectief te kleuren in menselijke sputummonsters, wat een eigenschap is die is geëxploiteerd in slide-gebaseerde en flowcytometrische diagnostische testen¹⁰.

Sommige porfyrines zijn bifunctioneel in die zin dat ze kunnen worden gebruikt als therapeutische en diagnostische middelen ^2,11. In biomedisch onderzoek worden dergelijke bifunctionele porfyrines gebruikt om te evalueren hoe hun vermogen om kankercellen selectief te richten en te doden een functie is van hun structuur en hoe het wordt beïnvloed door de aanwezigheid van andere verbindingen 12,13,14,15,16. Zowel de cellulaire opname van porfyrines als hun cytotoxiciteit kunnen op een flowcytometrisch platform op een high-throughput manier worden gemeten. De absorptie- en emissiespectra van fluorescerende porfyrines zijn complex, maar de meeste flowcytometrische platforms zijn uitgerust om ze correct te identificeren. Het absorptiespectrum van fluorescerende porfyrines wordt gekenmerkt door een sterke absorptieband in het bereik van 380-500 nm, bekend als de Soret-band. Twee tot vier zwakkere absorptiebanden worden over het algemeen waargenomen in het bereik van 500-750 nm (Q-banden)¹⁷. Een blauwe 488 nm laser, aanwezig in de meeste flowcytometers, of een violette laser (405 nm) kan licht van de juiste golflengte genereren om porfyrines te prikkelen. De emissiespectra van porfyrines vertonen meestal pieken in het bereik van 600-800 nm¹⁸, wat resulteert in zeer weinig spectrale overlap met fluoresceïne-isothiocyanaat of fycoerythrin (PE) fluoroforen, maar aanzienlijke overlap met andere vaak gebruikte fluoroforen, zoals allophycocyanine (APC), evenals tandemfluoroforen, zoals PE-Cy5 en anderen. Daarom zijn bij het gebruik van porfyrines in meerkleurige flowcytometrietests enkelvoudige fluorofoorcontroles essentieel om de spillover van fluorescentie in andere kanalen dan die welke is aangewezen om de fluorescentie van de porfyrine te meten, adequaat te corrigeren.

Idealiter zouden de enkelvoudige fluorofoorcontroles die worden gebruikt om de spillovermatrix voor een panel van fluoroforen te berekenen (ook wel “compensatiecontroles” genoemd) uit hetzelfde celtype of dezelfde celtypen bestaan als het monster. Het gebruik van de steekproef voor dit doel is echter niet optimaal als er om te beginnen zeer weinig steekproef is of als de doelpopulatie binnen de steekproef erg klein is (bijvoorbeeld als men wil kijken naar minimale restziekte of kankercellen in de vroege stadia van de ziekte). Een nuttig alternatief voor cellen zijn kralen gekoppeld aan dezelfde fluorofoor die wordt gebruikt om het monster te analyseren. Veel van dergelijke kralen zijn in de handel verkrijgbaar; Deze kralen zijn ofwel voorgelabeld met de gewenste fluorofoor (voorgelabelde fluorofoor-specifieke kralen)^19,20, of er kan een fluorescerend gelabeld antilichaam aan worden bevestigd (antilichaamvangkralen)^20,21. Hoewel commerciële compensatieparels beschikbaar zijn voor veel fluoroforen, zijn dergelijke kralen niet beschikbaar voor porfyrines, ondanks hun toenemende gebruik in fundamenteel en klinisch onderzoek.

Naast het behoud van monsters en positieve versus negatieve populaties van de juiste grootte, zijn de andere voordelen van het gebruik van kralen als compensatiecontroles het gemak van voorbereiding, lage achtergrondfluorescentie en uitstekende stabiliteit in de loop van de tijd²². Het potentiële nadeel van het gebruik van kralen als compensatiecontrole is dat het emissiespectrum van het fluorescerende antilichaam dat op kralen wordt gevangen, kan verschillen van dat van hetzelfde antilichaam dat wordt gebruikt om de cellen te labelen. Dit kan van specifiek belang zijn bij het gebruik van een spectrale flowcytometer²⁰. Daarom moet de ontwikkeling van kralen als compensatiecontrole worden uitgevoerd op de flowcytometer die zal worden gebruikt voor de test waarvoor de kralen zijn ontwikkeld. Bovendien moet de ontwikkeling van de kralen een vergelijking omvatten met cellen die zijn gelabeld met hetzelfde fluorescerende kleuringsreagens.

Hier beschrijven we de bereiding van TCPP-amine-gefunctionaliseerde polystyreencompensatieparels, waarvan de mediane fluorescentie-intensiteit in het detectiekanaal vergelijkbaar was met die van TCPP-gelabelde cellen in sputum, en hun gebruik als compensatiecontroles voor flowcytometrie. De autofluorescentie van equivalente, niet-gefunctionaliseerde kralen was voldoende laag voor hun gebruik als negatieve fluorescentiecompensatiecontroles. Bovendien vertoonden deze kralen stabiliteit in opslag gedurende bijna 1 jaar.

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. 1. Bereiding van de TCPP-stamoplossing, 1,0 mg/ml OPMERKING: Dit kan maandelijks worden voorbereid. Weeg met behulp van een analytische balans, spatel en weegpapier 49,0-50,9 mg TCPP. Rond het gewicht af op 1/10 van een milligram. Zet de gemeten hoeveelheid TCPP opzij beschermd tegen licht.OPMERKING: Gebruik een statisch pistool als de …

Representative Results

Dit protocol voor de TCPP-etikettering van kralen is relatief snel en efficiënt. Figuur 1 toont een representatieve uitkomst van het TCPP-kraaletiketteringsproces zoals bepaald door flowcytometrie. Figuur 1A toont het gestandaardiseerde profiel van regenboogkralen, zoals gedetecteerd in het juiste kanaal voor het detecteren van TCPP. Deze kralen dienen als QC voor de standaardisatie van de laserspanningen voor de detectie van TCPP door de flowcytometer. <strong…

Discussion

Ondanks de vele toepassingen van porfyrines bij kankerdiagnose en -therapieën², is er beperkte literatuur over hun potentiële gebruik als flowcytometrisch reagens voor de identificatie van kankerachtige versus niet-kankerachtige celpopulaties in primaire menselijke weefsels^24,25,26. Ons onderzoek naar de flowcytometrische analyse van humaan sputum^24,27<sup class="xref"…

Materials

Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable – 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable – 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365