Perle modificate con porfirina da utilizzare come controllo di compensazione nella citometria a flusso

Summary

Il protocollo descrive come le sfere di compensazione a base di porfirina per la citometria a flusso vengono preparate dalla reazione di perle di polistirene funzionalizzato con la porfirina TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC. Una procedura di filtrazione viene utilizzata per ridurre i sottoprodotti del particolato.

Abstract

La citometria a flusso può rapidamente caratterizzare e quantificare diverse popolazioni cellulari sulla base di misurazioni di fluorescenza. Le cellule vengono prima colorate con uno o più reagenti fluorescenti, ciascuno funzionalizzato con una diversa molecola fluorescente (fluoroforo) che si lega alle cellule selettivamente in base alle loro caratteristiche fenotipiche, come l’espressione dell’antigene della superficie cellulare. L’intensità della fluorescenza da ciascun reagente legato alle cellule può essere misurata sul citometro a flusso utilizzando canali che rilevano una gamma specifica di lunghezze d’onda. Quando vengono utilizzati più fluorofori, la luce dei singoli fluorofori spesso si riversa in canali di rilevamento indesiderati, il che richiede una correzione dei dati di intensità della fluorescenza in un processo chiamato compensazione.

Le particelle di controllo della compensazione, tipicamente perle polimeriche legate a un singolo fluoroforo, sono necessarie per ogni fluoroforo utilizzato in un esperimento di etichettatura cellulare. I dati delle particelle di compensazione del citometro a flusso vengono utilizzati per applicare una correzione alle misurazioni dell’intensità di fluorescenza. Questo protocollo descrive la preparazione e la purificazione di perle di compensazione del polistirene funzionanti covalentemente con il reagente fluorescente meso-tetra(4-carbossifenil) porfina (TCPP) e la loro applicazione nella compensazione della citometria a flusso. In questo lavoro, le perle di polistirene funzionalizzate con ammina sono state trattate con TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC (N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato) a pH 6 e a temperatura ambiente per 16 ore con agitazione. Le perle TCPP sono state isolate mediante centrifugazione e risospese in un tampone pH 7 per lo stoccaggio. Il particolato correlato al TCPP è stato osservato come sottoprodotto. Il numero di questi particolati potrebbe essere ridotto utilizzando un protocollo di filtrazione opzionale. Le perle TCPP risultanti sono state utilizzate con successo su un citometro a flusso per la compensazione in esperimenti con cellule di espettorato umano etichettate con più fluorofori. Le perle TCPP si sono dimostrate stabili dopo la conservazione in frigorifero per 300 giorni.

Introduction

Le porfirine sono di interesse da molti anni in campo biomedico grazie alla loro fluorescenza e alle proprietà tumorali ^1,2,3. Le applicazioni terapeutiche come la terapia fotodinamica (PDT) e la terapia sonodinamica (SDT) comportano la somministrazione sistemica di una porfirina a un paziente oncologico, l’accumulo del farmaco nel tumore e l’esposizione localizzata del tumore a una luce laser di una specifica lunghezza d’onda o ultrasuoni. L’esposizione alla luce laser o agli ultrasuoni porta alla generazione di specie reattive dell’ossigeno da parte della porfirina e alla successiva morte cellulare ^4,5. Nella diagnosi fotodinamica (PDD), la fluorescenza della porfirina viene utilizzata per distinguere le cellule tumorali dalle cellule normali⁶. In questo contesto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente naturale che si accumula nei tumori dopo l’iniezione sistemica o locale del suo precursore, l’acido 5-aminolevulinico (5-ALA), viene utilizzata per identificare i tumori stromali gastrointestinali, il cancro della vescica e il cancro al cervello ^7,8. Più recentemente, il trattamento con 5-ALA è stato esplorato come approccio per rilevare la malattia residua minima nel mieloma multiplo⁹. Il nostro laboratorio ha utilizzato la porfirina tetraarilica TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carbossifenil)-21,23 H-porfina) per la sua capacità di colorare selettivamente le cellule tumorali polmonari e le cellule associate al cancro in campioni di espettorato umano, che è una proprietà che è stata sfruttata in saggi diagnostici citometrici basati su vetrini e a flusso¹⁰.

Alcune porfirine sono bifunzionali in quanto possono essere utilizzate come agenti terapeutici e diagnostici ^2,11. Nella ricerca biomedica, tali porfirine bifunzionali sono utilizzate per valutare come la loro capacità di colpire selettivamente e uccidere le cellule tumorali sia una funzione della loro struttura e come sia influenzata dalla presenza di altri composti 12,13,14,15,16. Sia l’assorbimento cellulare delle porfirine che la loro citotossicità possono essere misurati su una piattaforma citometrica a flusso in modo ad alto rendimento. Gli spettri di assorbimento ed emissione delle porfirine fluorescenti sono complessi, ma la maggior parte delle piattaforme citometriche a flusso sono attrezzate per identificarle correttamente. Lo spettro di assorbimento delle porfirine fluorescenti è caratterizzato da una forte banda di assorbimento nell’intervallo 380-500 nm, nota come banda Soret. Da due a quattro bande di assorbimento più deboli sono generalmente osservate nell’intervallo 500-750 nm (bande Q)¹⁷. Un laser blu da 488 nm, presente nella maggior parte dei citometri a flusso, o un laser viola (405 nm) possono generare luce della lunghezza d’onda appropriata per eccitare le porfirine. Gli spettri di emissione delle porfirine mostrano tipicamente picchi nell’intervallo 600-800 nm¹⁸, il che si traduce in una sovrapposizione spettrale molto piccola con i fluorofori di isotiocianato di fluoresceina o ficoeritrina (PE), ma una notevole sovrapposizione con altri fluorofori spesso usati, come l’alloficocianina (APC), così come i fluorofori tandem, come PE-Cy5 e altri. Pertanto, quando si utilizzano le porfirine in saggi di citometria a flusso multicolore, i controlli a singolo fluoroforo sono essenziali per correggere adeguatamente lo spillover della fluorescenza in canali diversi da quello designato per misurare la fluorescenza della porfirina.

Idealmente, i controlli a singolo fluoroforo utilizzati per calcolare la matrice di spillover per un pannello di fluorofori (chiamati anche “controlli di compensazione”) dovrebbero essere costituiti dallo stesso tipo di cella del campione. Tuttavia, l’utilizzo del campione per questo scopo non è ottimale se c’è pochissimo campione per iniziare o se la popolazione target all’interno del campione è molto piccola (ad esempio, se si vuole guardare alla malattia residua minima o alle cellule tumorali nelle prime fasi della malattia). Un’alternativa utile alle cellule sono le perle accoppiate con lo stesso fluoroforo che viene utilizzato per analizzare il campione. Molte di queste perle sono disponibili in commercio; Queste perle sono premarcate con il fluoroforo desiderato (perle premarcate specifiche per fluorofori)^19,20, oppure un anticorpo marcato con fluorescenza può essere attaccato ad esse (perle di cattura degli anticorpi)^20,21. Mentre le perle di compensazione commerciali sono disponibili per molti fluorofori, tali perle non sono disponibili per le porfirine, nonostante il loro crescente uso nella ricerca di base e clinica.

Oltre alla conservazione del campione e alle popolazioni positive rispetto a quelle negative opportunamente dimensionate, gli altri vantaggi dell’uso delle perle come controlli di compensazione sono la facilità di preparazione, la bassa fluorescenza di fondo e l’eccellente stabilità nel tempo²². Il potenziale svantaggio dell’uso delle perle come controllo di compensazione è che lo spettro di emissione dell’anticorpo fluorescente catturato sulle perle può differire da quello dello stesso anticorpo utilizzato per etichettare le cellule. Questo può essere di particolare importanza quando si utilizza un citometro a flusso spettrale²⁰. Pertanto, lo sviluppo di perle come controllo di compensazione deve essere eseguito sul citometro a flusso che verrà utilizzato per il test per il quale vengono sviluppate le perle. Inoltre, lo sviluppo delle perle deve includere un confronto con le cellule etichettate con lo stesso reagente colorante fluorescente.

Qui, descriviamo la preparazione di perle di compensazione in polistirene funzionalizzato con ammina TCPP, la cui intensità mediana di fluorescenza nel canale di rilevamento era paragonabile a quella delle cellule marcate con TCPP nell’espettorato e il loro uso come controlli di compensazione per la citometria a flusso. L’autofluorescenza di sfere equivalenti e non funzionalizzate era sufficientemente bassa per il loro uso come controlli di compensazione della fluorescenza negativa. Inoltre, queste perle hanno dimostrato stabilità nello stoccaggio per quasi 1 anno.

Protocol

Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati. 1. Preparazione della soluzione madre TCPP, 1,0 mg / ml NOTA: Questo può essere preparato mensilmente. Utilizzando una bilancia analitica, una spatola e una carta da pesata, pesare 49,0-50,9 mg di TCPP. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo. Mettere da parte la quantità misurata di TCPP al riparo dalla luce.NOTA: Utilizzare un…

Representative Results

Questo protocollo per l’etichettatura TCPP delle perline è relativamente veloce ed efficiente. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del processo di marcatura delle perline TCPP determinato dalla citometria a flusso. La Figura 1A mostra il profilo standardizzato delle perline arcobaleno, come rilevato nel canale appropriato per il rilevamento di TCPP. Queste perle servono come QC per la standardizzazione delle tensioni laser per il rilevamento di TCPP…

Discussion

Nonostante le numerose applicazioni delle porfirine nella diagnosi e nella terapia del cancro², esiste una letteratura limitata sul loro potenziale uso come reagente citometrico a flusso per l’identificazione di popolazioni cellulari cancerose e non cancerose nei tessuti umani primari^24,25,26. La nostra ricerca sull’analisi citometrica a flusso dell’espettorato umano^{24,27</sup…}

Materials

Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable – 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable – 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365