フローサイトメトリーの補正コントロールとして使用するポルフィリン修飾ビーズ
Summary
このプロトコルでは、アミン官能化ポリスチレンビーズとポルフィリンTCPPおよびアミドカップリング試薬EDCとの反応によって、フローサイトメトリー用のポルフィリンベースの補償ビーズがどのように調製されるかについて説明しています。ろ過手順は、粒子状の副産物を減らすために使用されます。
Abstract
フローサイトメトリーは、蛍光測定に基づいて多様な細胞集団を迅速に特性評価および定量することができます。細胞はまず1つ以上の蛍光試薬で染色され、それぞれが異なる蛍光分子(蛍光色素)で機能化され、細胞表面抗原発現などの表現型特性に基づいて細胞に選択的に結合します。細胞に結合した各試薬からの蛍光強度は、指定された範囲の波長を検出するチャネルを使用してフローサイトメーターで測定できます。複数の蛍光色素を使用する場合、個々の蛍光色素からの光が望ましくない検出チャンネルにこぼれることが多く、補正と呼ばれるプロセスで蛍光強度データを補正する必要があります。
補償対照粒子(通常は単一の蛍光色素に結合したポリマービーズ)は、細胞標識実験で使用される各蛍光色素に必要です。フローサイトメーターからの補償粒子からのデータは、蛍光強度測定に補正を適用するために使用されます。このプロトコルでは、蛍光試薬メソテトラ(4-カルボキシフェニル)ポルフィン(TCPP)で共有結合的に官能基化されたポリスチレン補正ビーズの調製と精製、およびフローサイトメトリー補正への応用について説明します。本研究では,アミン官能化ポリスチレンビーズをTCPPとアミドカップリング試薬EDC(N-(3-ジメチルアミノプロピル)–N’-エチルカルボジイミド塩酸塩)でpH 6,室温で16時間撹拌しながら処理した。TCPPビーズを遠心分離により単離し、保存のためにpH7緩衝液に再懸濁した。TCPP関連の微粒子が副産物として観察された。これらの微粒子の数は、オプションのろ過プロトコルを使用して減らすことができます。得られたTCPPビーズは、複数の蛍光色素で標識されたヒト喀痰細胞を用いた実験において、補正のためにフローサイトメーターでうまく使用されました。TCPPビーズは、冷蔵庫で300日間保存した後、安定であることが証明されました。
Introduction
ポルフィリンは、その蛍光特性と腫瘍標的特性により、生物医学分野で長年にわたって関心を集めてきました1,2,3。光線力学療法(PDT)およびソノダイナミック療法(SDT)などの治療用途は、癌患者へのポルフィリンの全身投与、腫瘍における薬物の蓄積、および特定の波長のレーザー光または超音波への腫瘍の局所的曝露を伴う。レーザー光または超音波への曝露は、ポルフィリンによる活性酸素種の生成とそれに続く細胞死につながります4,5。光線力学的診断(PDD)では、ポルフィリン蛍光を使用して癌細胞と正常細胞を区別します6。これに関連して、プロトポルフィリンIXは、その前駆体である5-アミノレブリン酸(5-ALA)の全身または局所注射時に腫瘍に蓄積する天然の蛍光ポルフィリンであり、消化管間質腫瘍、膀胱癌、および脳腫瘍を特定するために使用されます7,8。最近では、多発性骨髄腫における最小限の残存病変を検出するためのアプローチとして5-ALA治療が検討された9。当研究室では、テトラアリールポルフィリンTCPP(5,10,15,20-テトラキス-(4-カルボキシフェニル)-21,23H-ポルフィン)を用いており、ヒト喀痰検体中の肺がん細胞やがん関連細胞を選択的に染色することができ、スライドベースやフローサイトメトリー診断アッセイで利用されている特性です10。
いくつかのポルフィリンは、治療薬および診断薬として使用できるという点で二機能性である2,11。生物医学研究では、このような二官能性ポルフィリンを使用して、癌細胞を選択的に標的にして殺す能力がそれらの構造の関数であり、他の化合物の存在によってどのように影響を受けるかを評価します12、13、14、15、16。ポルフィリンの細胞内取り込みとその細胞毒性の両方を、フローサイトメトリープラットフォームでハイスループットな方法で測定できます。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルと発光スペクトルは複雑ですが、ほとんどのフローサイトメトリープラットフォームはそれらを正しく識別するために装備されています。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルは、ソーレー帯として知られる380〜500nmの範囲の強い吸収帯によって特徴付けられる。一般に、500〜750 nmの範囲(Qバンド)で2〜4個の弱い吸収バンドが観察されます17。ほとんどのフローサイトメーターに存在する青色の488 nmレーザー、または紫色レーザー(405 nm)は、ポルフィリンを励起するための適切な波長の光を生成できます。ポルフィリンの発光スペクトルは通常、600〜800 nmの範囲にピークを示し18、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリン(PE)フルオロフォアとのスペクトルオーバーラップはほとんどありませんが、アロフィコシアニン(APC)などの他のよく使用されるフルオロフォアや、PE-Cy5などのタンデムフルオロフォアとはかなり重複します。したがって、マルチカラーフローサイトメトリーアッセイでポルフィリンを使用する場合、ポルフィリンの蛍光を測定するために指定されたチャネル以外のチャネルでの蛍光のスピルオーバーを適切に補正するには、シングルフルオロフォアコントロールが不可欠です。
理想的には、蛍光色素パネルのスピルオーバーマトリックスの計算に使用される単一蛍光色素コントロール(「補正コントロール」とも呼ばれます)は、サンプルと同じ細胞タイプで構成されている必要があります。ただし、そもそもサンプルが非常に少ない場合、またはサンプル内のターゲット集団が非常に少ない場合(たとえば、病気の初期段階で最小限の残存疾患または癌細胞を調べたい場合)は、この目的でサンプルを使用することは最適ではありません。細胞の有用な代替物は、サンプルの分析に使用されるのと同じ蛍光色素と結合されたビーズです。そのようなビーズの多くは市販されている。これらのビーズは、目的の蛍光色素で事前に標識されているか(標識済み蛍光色素特異的ビーズ)19,20、または蛍光標識された抗体をそれらに付着させることができます(抗体捕捉ビーズ)20,21。市販の補正ビーズは多くの蛍光色素に利用できますが、このようなビーズは基礎研究や臨床研究での使用が増加しているにもかかわらず、ポルフィリンには利用できません。
サンプルの保存と適切なサイズのポジティブ集団とネガティブ集団に加えて、ビーズを補償コントロールとして使用する他の利点は、調製の容易さ、低バックグラウンド蛍光、および長期にわたる優れた安定性です22。ビーズを補償コントロールとして使用することの潜在的な欠点は、ビーズに捕捉された蛍光抗体の発光スペクトルが、細胞の標識に使用される同じ抗体の発光スペクトルと異なる可能性があることです。これは、スペクトルフローサイトメーター20を使用する場合に特に重要であり得る。したがって、補償制御としてのビーズの開発は、ビーズが開発されるアッセイに使用されるフローサイトメーター上で行われる必要がある。さらに、ビーズの開発には、同じ蛍光染色試薬で標識された細胞との比較を含める必要があります。
ここでは、検出チャネル内の蛍光強度の中央値が喀痰中のTCPP標識細胞と同等であったTCPPアミン官能化ポリスチレン補正ビーズの調製と、フローサイトメトリーの補正コントロールとしての使用について説明します。同等の非官能化ビーズの自家蛍光は、負の蛍光補償対照として使用するには十分に低かった。さらに、これらのビーズは、ほぼ1年間の貯蔵安定性を示しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
癌の診断および治療におけるポルフィリンの多くの用途にもかかわらず2、初代ヒト組織における癌性細胞集団と非癌細胞集団を同定するためのフローサイトメトリー試薬としてのポルフィリンの使用の可能性に関する文献は限られています24、25、26。ヒト喀痰のフローサイトメトリー?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フィギュアの準備を支援してくれたDavid Rodriguezと、Navios EXフローサイトメーターの使用についてプレシジョンパソロジーサービス(テキサス州サンアントニオ)に感謝します。
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Riferimenti
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chimica. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochimica. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
