유세포 분석에서 보상 대조군으로 사용하기 위한 포르피린 변형 비드
Summary
이 프로토콜은 아민 작용화 폴리스티렌 비드와 포르피린 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC의 반응에 의해 유세포 분석을 위한 포르피린 기반 보상 비드를 준비하는 방법을 설명합니다. 미립자 부산물을 줄이기 위해 여과 절차가 사용됩니다.
Abstract
유세포 분석은 형광 측정을 기반으로 다양한 세포 집단을 신속하게 특성화하고 정량화할 수 있습니다. 세포는 먼저 하나 이상의 형광 시약으로 염색되며, 각각은 세포 표면 항원 발현과 같은 표현형 특성에 따라 세포에 선택적으로 결합하는 상이한 형광 분자(형광단)로 기능화됩니다. 세포에 결합된 각 시약의 형광 강도는 지정된 파장 범위를 감지하는 채널을 사용하여 유세포 분석기에서 측정할 수 있습니다. 여러 형광단을 사용하는 경우 개별 형광단의 빛이 원치 않는 검출 채널로 흘러 들어가는 경우가 많으며, 이는 보상이라는 프로세스에서 형광 강도 데이터를 수정해야 합니다.
보상 제어 입자, 일반적으로 단일 형광단에 결합된 폴리머 비드는 세포 표지 실험에 사용되는 각 형광단에 필요합니다. 유세포 분석기의 보상 입자 데이터는 형광 강도 측정에 보정을 적용하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 형광 시약인 메조테트라(4-카르복시페닐) 포르핀(TCPP)과 공유 작용화된 폴리스티렌 보상 비드의 준비 및 정제와 유세포 분석 보상에서의 적용에 대해 설명합니다. 이 작업에서, 아민 작용화 폴리스티렌 비드를 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카르보디이미드 염산염)로 pH 6 및 실온에서 16시간 동안 교반하면서 처리했습니다. TCPP 비드를 원심분리에 의해 단리하고, 보관을 위해 pH 7 완충액에 재현탁시켰다. TCPP 관련 미립자는 부산물로 관찰되었습니다. 이러한 미립자의 수는 선택적 여과 프로토콜을 사용하여 줄일 수 있습니다. 생성된 TCPP 비드는 다중 형광단으로 표지된 인간 객담 세포를 사용한 실험에서 보상을 위해 유세포 분석기에서 성공적으로 사용되었습니다. TCPP 비드는 냉장고에 300일 동안 보관한 후 안정적인 것으로 입증되었습니다.
Introduction
포르피린은 형광 및 종양 표적화 특성으로 인해 생물 의학 분야에서 수년 동안 관심의 대상이었습니다 1,2,3. 광역학 요법(PDT) 및 초음파 요법(SDT)과 같은 치료 적용은 암 환자에게 포르피린의 전신 투여, 종양에 약물 축적, 특정 파장 또는 초음파의 레이저 광에 대한 종양의 국소 노출을 수반합니다. 레이저 광선 또는 초음파에 노출되면 포르피린에 의한 활성 산소 종의 생성과 그에 따른 세포 사멸이 일어난다 4,5. 광역학 진단(photodynamical, PDD)에서 포르피린 형광은 암세포와 정상세포를 구별하는 데 사용된다6. 이러한 맥락에서, 전구체 인 5- 아미노 레불린 산 (5-ALA)의 전신 또는 국소 주사시 종양에 축적되는 천연 형광 포르피린 인 protoporphyrin IX는 위장관 간질 종양, 방광암 및 뇌암을 확인하는 데 사용됩니다 7,8. 최근에는 다발성 골수종에서 최소 잔류 질환을 검출하기 위한 접근법으로 5-ALA 치료법이 연구되었다9. 우리 연구실은 인간 객담 샘플에서 폐암 세포와 암 관련 세포를 선택적으로 염색하는 능력을 위해 테트라아릴 포르피린 TCPP(5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphine)를 사용해 왔으며, 이는 슬라이드 기반 및 유세포 분석 분석 분석에서 활용된 특성이다10.
일부 포르피린은 치료 및 진단제로 사용될 수 있다는 점에서 이중 기능성이다 2,11. 생물 의학 연구에서, 이러한 이중 기능성 포르피린은 암세포를 선택적으로 표적화하고 죽이는 능력이 다른 화합물 12,13,14,15,16의 존재에 의해 어떻게 영향을 받는지뿐만 아니라 암세포를 선택적으로 표적화하고 죽이는 능력이 어떻게 작용하는지 평가하는 데 사용됩니다. 포르피린의 세포 흡수와 세포 독성은 모두 고처리량 방식으로 유세포 분석 플랫폼에서 측정할 수 있습니다. 형광 포르피린의 흡수 및 방출 스펙트럼은 복잡하지만 대부분의 유세포 분석 플랫폼은 이를 정확하게 식별할 수 있는 장비를 갖추고 있습니다. 형광 포르피린의 흡수 스펙트럼은 Soret 밴드로 알려진 380-500 nm 범위의 강한 흡수 밴드를 특징으로합니다. 2-4 개의 약한 흡수 밴드는 일반적으로 500-750 nm 범위 (Q 밴드)에서 관찰됩니다 17. 대부분의 유세포 분석기에 존재하는 청색 488nm 레이저 또는 보라색 레이저(405nm)는 포르피린을 여기시키기 위해 적절한 파장의 빛을 생성할 수 있습니다. 포르피린의 방출 스펙트럼은 전형적으로 600-800 nm 범위(18)에서 피크를 나타내는데, 이는 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 피코에리트린(PE) 형광단과는 스펙트럼 중첩이 거의 없지만, 알로피코시아닌(APC)과 같이 자주 사용되는 다른 형광단뿐만 아니라 PE-Cy5 등과 같은 탠덤 형광단과는 상당히 겹친다. 따라서 다색 유세포 분석에서 포르피린을 사용할 때 포르피린의 형광을 측정하도록 지정된 채널이 아닌 다른 채널에서 형광의 유출을 적절하게 보정하기 위해 단일 형광단 제어가 필수적입니다.
이상적으로, 형광단 패널에 대한 스필오버 매트릭스를 계산하는 데 사용되는 단일 형광단 대조군(“보상 대조군”이라고도 함)은 샘플과 동일한 세포 유형으로 구성되어야 합니다. 그러나 시작할 샘플이 거의 없거나 샘플 내의 대상 모집단이 매우 작은 경우(예: 질병의 초기 단계에서 최소 잔류 질병 또는 암세포를 확인하려는 경우) 이러한 목적으로 샘플을 사용하는 것은 최적이 아닙니다. 세포에 대한 유용한 대안은 샘플을 분석하는 데 사용되는 동일한 형광단과 결합된 비드입니다. 많은 이러한 비드가 시판되고 있으며; 이러한 비드는 원하는 형광단(prelabeled fluorophore-specific beads)19,20으로 사전 표지되거나 형광 표지된 항체가 부착될 수 있습니다(항체 캡처 비드)20,21. 상업적인 보상 구슬은 많은 형광단에 사용할 수 있지만 이러한 구슬은 기초 및 임상 연구에서 사용이 증가하고 있음에도 불구하고 포르피린에 사용할 수 없습니다.
시료 보존 및 적절한 크기의 양성 대 음성 모집단 외에도, 비드를 보상 대조군으로 사용하는 것의 다른 이점은 준비의 용이성, 낮은 배경 형광 및 시간 경과에 따른 우수한 안정성입니다22. 비드를 보상 대조군으로 사용할 때의 잠재적인 단점은 비드에 포획된 형광 항체의 방출 스펙트럼이 세포를 표지하는 데 사용된 동일한 항체의 방출 스펙트럼과 다를 수 있다는 것입니다. 이것은 스펙트럼 유세포 분석기(20)를 사용할 때 특히 중요할 수 있다. 따라서 보상 제어로서의 비드의 개발은 비드가 개발되는 분석에 사용될 유세포 분석기에서 수행되어야 합니다. 또한, 비드의 개발에는 동일한 형광 염색 시약으로 표지된 세포와의 비교가 포함되어야 합니다.
여기에서는 검출 채널의 중간 형광 강도가 객담의 TCPP 표지 세포의 형광 강도와 비슷한 TCPP 아민 기능화 폴리스티렌 보상 비드의 제조와 유세포 분석을 위한 보상 대조군으로 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 동등하고 기능화되지 않은 비드의 자가형광은 음성 형광 보상 대조군으로 사용하기에 충분히 낮았습니다. 또한, 이들 비드는 거의 1년 동안 보관시 안정성을 입증하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암 진단 및 치료학에 포르피린이 많이 적용되고 있음에도 불구하고2, 일차 인간 조직에서 암성 대 비암성 세포 집단을 식별하기 위한 유세포 분석 시약으로서의 포르피린의 잠재적 용도에 대한 문헌은 제한적이다24,25,26. 인간 객담24,27의 유세포 분석에 대한 우리의…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Navios EX 유세포분석기를 사용하기 위해 수치 준비 및 정밀 병리학 서비스(텍사스주 샌안토니오)에 도움을 준 David Rodriguez에게 감사드립니다.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Riferimenti
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